单克隆抗体制备.

实验研究的目的性—功能、形态、数量实验设计的科学性—全面、动态、鲜明、对应、对照实验方法的合理性—确切、先进实验原理的内涵性—意义、要点实验操作的规范性—准备、严格、准确、重复免疫血清和单克隆抗体的制备一、免疫血清的制备1.原理：机体具有多种B细胞克隆，将适当的抗原物质注入人或动物体内后可被不同的B细胞克隆同时识别，经过一定时间，受刺激的B细胞克隆针对抗原表位的多少而产生相应的特异性抗体，每一抗原表位都能诱发相应B细胞克隆产生单克隆抗体，此获得的血清即为含多种单克隆抗体的混合物，称之为多克隆抗体免疫血清，简称免疫血清。优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的免疫应答能力。此外，尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔和有无佐剂等因素。免疫原1.抗原种类微生物抗原、组织抗原和免疫球蛋白抗原。2.抗原纯度一般的抗原只要达到亲合层析或SDS－PAGE电泳纯即可。3.抗原用量在一定范围内与免疫应答强度呈正相关。在应用完全弗氏佐剂时，蛋白质类抗原剂量以0.5～1mg/kg体重为宜，加强免疫约为基础剂量的1/2～1/3。4.抗原的处理1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml为宜。2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂（1：1V/V）混合、乳化。3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联剂。佐剂1.概念佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应答的类型。2.种类1）卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌（CP）、脂多糖（LPS）、细胞因子；2）氢氧化铝、明矾；3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（polyI：C）和双链多聚腺苷酸：鸟苷酸（polyA：U）；4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物（ISCOMs）、CPG寡核苷酸。3.弗氏完全佐剂1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。2）配方：羊毛脂：液体石蜡为1：2，也可1：1。灭活卡介苗（2～20mg/ml）。4.弗氏不完全佐剂，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐剂。5.用法：佐剂与抗原等量混合，充分乳化。动物选择对免疫动物的主要要求有：1.应选择与抗原物质亲缘关系远的动物，特别是在制备抗免疫球蛋白血清时更要注意。抗原物质的来源生物与被免疫动物亲缘关系越远，免疫应答能力越强，抗体产生水平越高，抗体亲和力也越强。2.动物生理状态正常，发育成熟，体重符合规定。家兔初始免疫体重通常在2～2.5kg。3.性别上以雄性成年动物较常用，也可采用雌性非妊娠动物。不能应用患病或刚刚病愈、有免疫缺陷或应用免疫抑制剂的动物。免疫方法1.免疫途径1）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和淋巴结等。2）免疫方法：小剂量、多点、多途径方法。3）颗粒性抗原（细菌悬液、红细胞悬液）采用小鼠腹腔注射。4）可溶性抗原（如IgG）采用弗氏完全佐剂的乳剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。2.可溶性抗原免疫1）方法：基础免疫（初次免疫）后三周左右，进行加强免疫，以后每隔2周加强免疫一次。2）加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静脉、小鼠眶静脉少量采血，分离血清，免疫双扩实验测定血清效价1：32或ELISA法测定抗体效价1：10000，表明抗体效价较高，可采兔颈动脉或心脏全部血液，分离血清。4）如抗体效价较低，继续加强免疫，一般需4～5次。若仍不能达到抗体效价要求，应考虑重新免疫。3.颗粒性抗原免疫第一周注射2次，随后每周加强免疫1次，4～5天试血。3.操作程序1）健康雄性家兔体重2.5～3kg，背部皮下多点注射。2）基础免疫：抗原＋完全佐剂(抗原剂量4mg/只)2ml(1:1V/V)吸入两支注射器内，三通连接，反复推拉混合至乳化悬液。3）加强免疫：抗原＋不完全佐剂(抗原剂量2.5mg/只)，间隔7～10天加强一次。约2～3次。4）试血：末次注射后第7天取少量静脉血，免疫双扩试验血清检测，抗血清效价1：32（或ELISA法检测抗体效价1：10，000）时颈动脉放血，分离血清，分装，保存。二单克隆抗体的制备1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度准确的新纪元。1.原理根据致敏的单一B细胞克隆具有分泌特异性抗体和骨髓瘤细胞在体外长期增殖的特性，采用细胞融合技术在体外可将上述两种细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞因具备了B细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，即可分泌抗体，又能在HAT培养基中长期存活。因此，可通过HAT选择性培养，筛选出克隆化目的杂交瘤细胞株，再利用杂交瘤细胞培养上清或杂交瘤细胞接种小鼠产生的腹水，获取大量的来源于杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体（monoclonalantibody,mAb）。2.试剂与器材（1）细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）（2）0.2mol/LL-谷氨酰胺贮存液（3）200双抗（青、链霉素）溶液（4）RPMI-1640培养液（5）15%胎牛血清RPMI-1640培养液（6）100氨基蝶呤（A）贮存液（7）100次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液（8）1HAT培养液（9）1HT培养液（10）1008-杂氮鸟嘌呤贮存液（11）细胞冻存液：90ml含30%FCS的RPMI-1640培养液+10mlDMSO（12）0.2MpH7.4磷酸盐缓冲液（13）主要仪器设备：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、精密天平、低温和普通冰箱、液氮罐、离心机、高压灭菌器、烤箱、水浴锅、除菌滤器、酶联免疫测定仪等。（14）常规实验器材：血细胞记数板、各种吸管、离心管、细胞培养瓶、培养皿、24孔和96孔培养板、细胞冻存管、注射器、微量移液器等。（15）抗体纯化器材与试剂。（16）小鼠实验器材：手术剪刀、镊子等解剖器材。（17）骨髓瘤细胞：小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0或NS-1。3.实验流程（1）实验动物免疫：BALB/c小鼠，雌性，6～8W。常规免疫方案：0、15、30天，72h后制备脾细胞悬液。基础免疫：10～100g抗原(可溶性抗原)＋完全佐剂0.2ml(1:1V/V)，背部皮下多点注射。加强免疫：同量抗原＋不完全佐剂，间隔7～10天一次。约2～3次，皮下或腹腔注射。试血：取静脉血，ELISA法检测血清中抗体滴度，当效价达到1：400以上时，进行加强免疫。弱免疫原免疫方案：0天、30天、45天、60天、75天。（2）免疫动物脾细胞悬液的制备：将末次免疫后3天BALB/c小鼠处死，消毒，无菌取出脾脏，置入无菌PBS或培养液中。在100目的钢网上研磨脾脏。收集细胞于50ml离心管中，1500rpm离心5分，去上清。加入10mlPBS用吸管轻微混匀，1500rpm离心5分，去上清，用10mlRPMI培养液悬浮。细胞计数（细胞数/ml=N/4104稀释倍数）用1640培养液调整细胞浓度至1108/ml（3）饲养细胞制备在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的细胞称饲养细胞。常用的是小鼠腹腔巨噬细胞。将正常BALB/c小鼠腹部消毒后，注射预冷的无血清培养液5ml，轻揉腹部数次，于腹部左下处剪开腹膜，吸取细胞悬液，反复2～3次，用培养液离心洗涤2次。用15%FCS-RPMI-1640调细胞浓度为2105/ml，将细胞接种于96孔培养板，100l/孔。（4）骨髓瘤细胞的准备复苏骨髓瘤细胞用10％FCS-RPMI-1640培养液培养1周，2～3天换液一次，依细胞生长情况3～4天传代一次，适宜密度3×105/ml。融合之前3天，每天换一半培养液，使细胞保持在对数生长期。取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次，调细胞浓度为1～2107/ml备用。（5）细胞融合1）将骨髓瘤细胞与脾脏细胞按1：10或1：5的比例混合，在50ml离心管中用无血清培养液洗1次，离心弃上清；2）1min内加入37℃预温的1ml50％PEG溶液，边加边摇37℃水浴1min；3）加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml；4）离心，弃上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液重悬；5）将上述细胞加入已有饲养细胞的96孔培养板内，每孔100l，放入37℃5％CO2培养箱培养。（6）融合细胞观察、换液及杂交瘤抗体检测细胞培养3天后，使用HAT培养液换液；3天后，再次使用HAT培养液换液。当细胞克隆集落大于3mm时，利用间接ELISA法筛选分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆。（7）杂交瘤细胞克隆化将分泌单克隆抗体阳性的杂交瘤细胞克隆按有限稀释法稀释细胞（用HAT培养液稀释细胞），于96孔培养板中加入0.1ml/孔，培养2周，利用间接ELISA法挑选单个阳性杂交瘤细胞克隆孔并再次进行亚克隆，直至亚克隆时全部克隆孔细胞培养上清中抗体检出阳性率为100%为止。（8）杂交瘤细胞冻存与复苏将阳性细胞克隆在培养板或培养瓶中扩大培养，收集细胞，离心1000转、5分，弃上清，加入细胞冻存液，移至冻存管，-70℃冰箱过夜，然后液氮长期保存。将冻存管从液氮中取出，立即放入37℃水浴中，使之迅速融化。用培养液洗涤1次后，加入培养液继续培养。（9）单克隆抗体的大量制备BALB/c雌性小鼠接种杂交瘤细胞前1～2周，腹腔注射降植烷预处理。用无血清培养液洗涤杂交瘤细胞2～3次，调细胞浓度1～2106/ml，每只小鼠腹腔注射0.5～1ml细胞悬液。待小鼠腹部明显膨大时，收集腹水，离心，收集上清，分装，-80℃保存。（10）单克隆抗体纯化①盐析法腹水10ml＋等量生理盐水混匀，在电磁搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸胺20ml，4℃放置0.5h以上或过夜。离心（3000rpm）30min，弃上清。沉淀加生理盐水20ml溶解后，再次加入饱和硫酸胺10ml，4℃放置0.5h或过夜。离心（3000rpm）30min，弃上清。沉淀加尽量少生理盐水溶解，装入透析袋中，用流动自来水透析40min，再用生理盐水透析24h，中间换液3~4次，检测无NH4离子存在即可。-20℃备用。②凝胶柱层析实验原理：凝胶本身是多孔的分子筛，在交联剂作用下形成三维空间网状结构，蛋白质溶液流经凝胶柱时，根据蛋白质分子量的大小不同，由大到小洗脱而进行分离。（大分子蛋白质不能进入凝胶粒内部，在胶粒间隙随洗脱液最先流出。而小分子蛋白质进入胶粒内部洗脱较慢。）关键点：1.装柱切忌有气泡和断层，有断层要重装柱；2.加样时缓冲液面恰好在滤纸片上，及时加样避免柱干涸，干涸凝胶不能继续使用；3.因操作时间长，宜在4℃操作，防止影响免疫球蛋白活性。（11）单克隆抗体免疫学性质检定1）单克隆抗体特异性测定；2）单克隆抗体亚类测定；3）单克隆抗体效价测定；4）亲和力测定；5）识别抗原表位的测定。4.单克隆抗体制备的几处要点：1）相对分子量为4000的PEG融合效率最高。2）免疫原性较强的抗原可不用佐剂，但一般可溶性蛋白抗原免疫时需要佐剂，并且乳化要充分。一般多采用背部多点注射法免疫小鼠3～5只。3）选用高质量血清，细胞融合时可不用饲养细胞，但亚克隆时应加入饲养细胞。4）为防止骨髓瘤细胞发生次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶的逆转，应定期用8-杂氮鸟嘌呤处理骨髓瘤细胞。5）应选用对数生长期的骨髓瘤细胞进行融合。胎牛血清的质量直接影响细胞融合，应选用高质量的血清。6）在克隆化过程中，应逐渐用普通的RPMI-1640培养液以1/2的速度替代HAT培养液；用生长良好的阳性杂交瘤细胞进行扩大培养。7）通过有限化稀释，使每孔含0.5～1个杂交瘤细胞，这样有利于挑选单一的细胞克隆。