单克隆抗体制备

单克隆抗体制备标准化操作流程（）1、单克隆抗体的制备原理1.1单克隆抗体技术概念B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化得杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性坑提的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化得杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量高效价、单一的特异性抗体。这种技术即成为单克隆抗体技术。1.2HAT培养基筛选原理（1）氨甲喋呤（A）是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨甲螺呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。（2）瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径合成DNA而繁殖。B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存活5~7d，且功能下降).（3）融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。在HAT选择培养基上由于变异的癌细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶而合成DNA。只能利用尿酰胺和尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基嘌呤阻断，所以未融合的癌细胞会死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA,克服氨基嘌呤的阻断，因此杂交瘤细胞被大量繁殖并被筛选。2、单克隆抗体制备流程3、2.1动物免疫取4-6周龄BALB/c雌鼠3只，用纯化的重组蛋白或者病毒（蛋白选用切胶纯化或者柱纯化的方式获得；病毒通过细胞繁殖病毒后，将病毒进行超离）加等体积弗氏完全佐剂进行腹腔注射，首免每只小鼠蛋白50μg（病毒每只200ug）；15天后加弗氏不完全佐剂免疫，剂量同前；15天后腹腔注射抗原，剂量同前；3天后取小鼠脾细胞供细胞融合（方便获得IgG2b，方便进行检测）。2.2饲养层细胞的制备在融合前1天，选择健康BALB/c雌性小鼠拉颈处死，75%酒精浸泡消毒5min（消毒充分），固定于解剖板上，移入超净工作台，用镊子提起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口（注意不可损伤腹膜），经钝性剥离使腹膜充分暴露。用酒精擦拭消毒，用一次性无菌注射器吸取含20%胎牛血清HAT选择培养液5-6ml注入小鼠腹腔，右手固定注射器保持不动，左手用镊子夹取酒精棉球轻轻揉动小鼠腹部1-2min，再用注射器吸出腹腔内的培养液（内含巨噬细胞），加入到备好的HAT培养基中，将细胞悬液加入到96孔细胞培养板中，每孔0.1ml，37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。18-24h后观察细胞生长状态，细胞呈多形性，贴壁紧密，折光性好时可用。2.3骨髓瘤细胞的准备融合前两周从液氮中取出骨髓瘤细胞进行复苏，于融合前48-36小时扩大培养，待细胞生长状态良好而处于生长对数期时可用于融合。融合当天，将处于生长旺盛的细胞收集至离心管中，1000r/min离心10min，弃去上清，用基础培养液洗涤一次后，将细胞重新悬浮，计数，用于融合。2.4脾淋巴细胞的准备取免疫的BALB/c小鼠，眼球摘除放血，分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。将小鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75%酒精消毒5min，移入超净工作台内，固定于解剖板上，用灭菌剪刀、镊子分别剪开皮肤和腹膜，无菌取出脾脏，放入已盛有基础培养液的无菌平皿中清冼，剥离被膜上的结缔组织。将脾脏移入另一盛有10ml基础培养液的平皿内，用针头将脾脏一端刺孔，另一端用无菌镊子夹起固定，用一次性无菌注射器吸取10ml基础培养液，从脾脏一端缓慢注入，使液体从脾脏另一端针孔流出，重复多次，尽量将细胞洗出。将平皿中脾细胞悬液转移到10ml离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，补液至2ml，重悬细胞，计数。2.5细胞融合取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞按细胞数量8：1混合，加入10ml的离心管内，1000r/min离心10min，弃上清；用手指轻击管底，使两种细胞充分混匀；将离心管置于37℃水浴的烧杯中，吸取37℃预热的50%PEG溶液0.6ml在60s内缓慢滴入，边滴边转动离心管，然后静止90s，立即在5min内加入10ml37℃预热的不含血清的RPMI-1640培养液使PEG稀释而失去促融作用。在第1min加1ml，在第2min加4ml，随后3min内加完剩余液体。1000rpm离心10min，弃上清，加入培养液，再洗一次，以除去剩余PEG。将沉淀细胞轻悬于含20%胎牛血清的预温HAT选择培养液中，混合均匀，加入到已加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μl，将培养板移至37℃、5%CO2饱和湿度温箱中培养。2.6融合细胞的培养和筛选融合后的细胞每3天更换培养液一次，采用半换液方式（弃去100uL旧培养液，补100uLHAT培养液）。所用的培养液按培养时间的不同而有所不同，在融合后第3、6天内用HAT培养液；第9、12天用HT培养液，第15天后用普通的完全1640培养液。2.7融合细胞的培养和筛选融合后的细胞每3天更换培养液一次，采用半换液方式。所用的培养液按培养时间的不同而有所不同，在融合后第3、6天内用HAT培养液；第9、12天用HT培养液，第15天后用普通的完全培养液。待杂交瘤细胞长满孔底1/4-1/3时，于换液3-4天后即可在无菌条件下取细胞培养上清液100ul，不作稀释，用已建立的筛选方法对上清进行检测，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对照，并设阳性、阴性血清对照和空白对照，测出的阳性孔及时进行克隆化。采用液相有限稀释法进行细胞克隆：将已检测为分泌阳性的特定孔中杂交瘤细胞集落吹起混匀，取出至无菌小瓶中准确计数后进行系列稀释到1ml含10个细胞，将稀释好的细胞悬液100μl加入到事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中培养。适时换液并将克隆化剩余细胞进行扩大培养冻存。亚克隆后10天左右，选取单克隆孔上清进行检测，从中选取1个阳性孔再进行亚克隆，方法同上，直至筛选结果100%阳性为止。2.8杂交瘤细胞的冻存将阳性细胞转至24孔板扩大培养，再转至培养瓶中扩大培养，收集培养上清保存备用。将处于对数生长期、状态良好的细胞从培养瓶中吹打下来，1000rpm离心10min，弃上清，用细胞冻存液（含10%DMSO、90%胎牛血清）将细胞稀释成106个/ml，加入到1.8ml细胞冻存管中，做好标记。4℃预冷30min，-20℃放置60min，再移至－70℃低温冰箱中过夜，次日放入液氮保存。2.9杂交瘤细胞的复苏自液氮罐中取出冻存管，迅速放入盛有37℃水烧杯中，不停摇动使其迅速融化，移至超净工作台，无菌开启冻存管，缓慢加入不含血清的PRMI-1640培养液，1000rpm离心10min，以5ml完全培养液重悬细胞沉淀，移入细胞培养瓶中，置5%CO2、、37℃饱和湿度培养箱中培养。2.10单克隆抗体的大量制备及效价测定将筛选出的阳性杂交瘤细胞加入培养瓶中扩大培养，细胞浓度以1×106-2×106/ml为佳，然后收集培养上清液，分装，并检测上清抗体效价，-70℃保存备用。制备腹水时，需将BALB/C小鼠预先用液体石蜡致敏，1周后经腹腔内接种约1×105个杂交瘤细胞，观察小鼠状态。待肿瘤生长8－15d（视腹水形成情况而定）收集腹水，1000r/min离心10分钟，上清即为腹水，三氯甲烷处理腹水去脂，分装、标记，检测抗体效价，-70℃保存备用。间隔2-3天，待腹水再生积聚后，同法再取，一只小鼠一般可抽取2-3次。杂交瘤细胞产生的腹水沉淀物用RPMI-1640培养液重悬，一部分注入致敏过的BALB/C小鼠腹腔重新制备腹水，另一部分可进行冻存。4、单克隆抗体的应用诊断试剂蛋白提纯（单抗与蛋白亲和性较好）肿瘤的导向治疗和免疫治疗技术5、单克隆抗体制备注意事项污染的问题（真菌污染、细菌污染、支原体污染）融合技术上的失败——无免疫应答（小鼠未产生相应的免疫应答，无法产生相应抗体）骨髓瘤细胞筛选（8-AG)（SP2/0细胞影响融合效果）阳性克隆的筛选尽早（不分泌抗体的细胞长势较快，易竞争营养使产生抗体的细胞凋亡）筛选出来的单抗应尽早冻存，避免单抗的染色体丢失、污染等问题