单分子荧光共振能量转移技术

研究生光谱技术与应用课程作业河南大学单分子荧光共振能量转移技术学生：郭爱宇学号：104753120870学院：物理与电子学院年级专业：2012级光学工程课程名称：光谱技术及应用指导老师：郭立俊教授单分子荧光共振能量转移技术摘要：单分子荧光共振能量转移技术(singlemoleculefluorescenceresonanceenergytransfer,smFRET)通过检测单个分子内的荧光供体及受体间荧光能量转移的效率，来研究分子构象的变化。在单分子探测技术发展之前，大多数的分子实验是探测分子的综合平均效应(ensembleaverages)，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。单分子探测可以对体系中的单个分子进行研究，得到某一分子特性的分布状况，也可研究生物分子的动力学反应。介绍了近来单分子荧光共振能量转移技术的进展。关键词：单分子；荧光共振能量转移；荧光基团1引言光谱技术是研究生物分子最常用的方法之一。在单分子光谱（singlemoleculespectroscopy,SMS）探测技术发展以前，大多数的实验是探测分子的综合平均效应，得到的是由大量对象组成的一个整体所表现出的平均响应和平均值，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。而单分子探测可对体系中的单个分子进行研究，通过与时间相关过程的探测，能实时了解生物大分子构象变化的信息。2002年美国第46届生物物理年会表明单分子仍是生物物理学目前和今后重点发展的研究领域。主要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子荧光能量转移谱、与原子力显微镜结合进行单分子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行单分子操作的激光光钳，高时间分辨率的单分子轨迹追踪等[1]。由此可见，单分子荧光技术具有重要的地位。标记在生物大分子上单个荧光基团的各种特性变化能够提供有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度(molecularfreedomofmotion)及在化学和静电环境下活性改变的信息。近年，在动态结构生物学研究领域，用单分子荧光光谱技术研究生物分子构象变化的方法主要有两种：一是通过单分子荧光偏振的各向异性（singlemoleculefluorescencepolarizationanisotropy，smFPA）研究生物分子的构象动力学(conformationaldynamics)和旋转运动(rotationalmotions)。另一个是单分子对荧光共振能量转移(singlepairfluorescenceresonanceenergytransfer,spFRET)，在单分子水平测量一个分子内或两个不同分子间的距离变化和相互作用。本文主要就后者做简要介绍。2单分子荧光共振能量转移技术（smFRET）2.1smFRET原理荧光共振能量转移是指当两种不同的荧光生色团离的较近，且其中一种生色团（供体，donor）的发射谱与另一种生色团（受体，acceptor）的激发谱有相当程度的重叠时，当供体被激发时，受体会因供体激发能的转移而被激发。其直观表现就是供体产生的荧光强度较其单独存在时要低的多，而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随它们荧光寿命的相应缩短和延长。能量转移效率与两个生色团激发谱和发射谱的重叠程度、供体与受体跃迁偶极的相对取向、供受体间的距离有密切关系，其经典公式为E=R06/(R6+R06)，R0为能量传递达到50%的距离。选定供、受体对之后，可将R0看作恒量。能量转移的发生将改变供、受体的去偏振程度、荧光寿命、荧光强度等，测定这些参数值就可得出E。利用R0和实验测得的E就可测得供受体间的距离R。用此方法测量生色团距离的方法被称为光谱尺，可测量1.0-10.0nm之间的距离。smFRET是在一个生物大分子或两个相互作用的分子上标记两个不同的荧光基团。同样，当供体的发射光谱与受体的吸收光谱相重叠时，发生共振能量转移。通过探测能量转移效率，就可确定两点间的距离。由于相对取向和光谱重叠积分等不确定因素，该方法不能准确确定绝对距离。但可通过监测供体-受体的相对距离变化，结合其时间变化推测生物大分子在生命活动中的构象变化。该技术不仅有非常好的静态定位能力，也能提供分子内或分子间两个荧光基团在距离和方向上的动态变化。由于每次只观察一对供、受体系统，因此能在毫秒时间尺度内观察这些变化，从而将具有不同能量转移效率的亚群分开。将这种方法扩展，可用于研究生物多聚体的组成动力学、DNA限制性内切酶酶切反应，以及DNA发夹结构的去折叠等[2-7]。2.2smFRET的特点单分子技术的优势使其在生物领域受到极大的青睐。例如在不均一的体系中，单分子技术能直接反映分子特性的分布状态。此外，在复杂的生物化学反应中，单分子技术能够在不同步化每一步反应的情况下研究每一步的动态化学反应[8,9]。2.2.1smFRET研究群体的分布状态当单个生物分子的FRET值确定后，可以通过FRET值的分布作出生物分子的统计图[10]。这种方法不局限于smFRET技术，还有其他的方法也能达到这一目的。可以假设有一个不均一的样品，包含两个不同的群体，每一个群体有不同的FRET值。传统的整体稳态FRET测量只能得到单一的FRET值，即整个样品的平均FRET值，但是它不能反映出样品的不均一性。而smFRET方法通过生物分子的统计图能很直观的检测出样品的群体分布状态，以及每一个群体的FRET值(图1A)。2.2.2smFRET研究生物分子的动力学反应对于生物化学反应，如果想用整体FRET来研究动力学反应，得出反应的动力学参数，需要用各种方法来使反应同步化，使每一个分子处于反应的同一状态，然后在外加的因子下启动反应。如果反应无法同步化，整体FRET的方法就无法对反应的动力学进行研究。但是smFRET并不受生物化学反应同步化的限制(图1B)。同时smFRET还能探测到稀有的构象变化以及非富集中间产物的形成[11]。这些是很难用整体FRET检测到的。图1smFRET能检测不同的构象。A,LeuT在无Na+的条件下，smFRET能检测出两个FRET的峰，而整体FRET的方法只能得到平均的FRET值(虚线)；B,smFRET能检测到单个LeuT分子构象间的转化，进而得到分子动力学参数，这些信息很难应用整体FRET的方法得到。3smFRET实验设计3.1实验设备单分子荧光探测必须满足两个基本要求，一是在被照射的体积中只有一个分子与激光发生相互作用；二是要确保单分子的信号大于背景的干扰信号。背景信号来自于Raman散射、Rayleigh散射、溶剂中杂质、盖玻片产生的荧光和探测器的暗电流。因此，进行单分子探测要求(1)激发容积要小，因为背景的吸收与激发体积成正比，尽量减小激发体积可降低背景干扰，（2）高效的收集光学系统，（3）灵敏的探测器，（4）采用针孔装置，或将溶剂中杂质预漂白以及用低荧光光学材料等方法清除背景荧光。常用的装置是近场光学扫描显微镜(near-fieldscanningopticalmicroscopeNSOM)，其最小激发体积小于10-2μm3。该方法在单分子荧光的探测中发挥了很重要的作用。可监测单个生物大分子的构造变化，例如旋转和纳米水平上的距离变化。其不足是扫描时需要通过复杂的控制系统来保持适当的样品与探针之间的距离，并且其近场激发对所研究的生物体系有微扰作用，给研究带来许多限制。共聚焦激光扫描显微镜(ConfocalscanningopticalmicroscopeCSOM)[12-13]，也是常用装置之一。在其光学设计中，激光束经物镜聚集到样品上形成一个接近衍射极限的光斑，利用同一物镜收集样品反射回的光，经一个共焦小孔后被探测器接收，而非焦面的光则被小孔滤掉，从而保证了良好的光学收集效率和高信噪比。为了实现宽场显微观察，可通过常规荧光显微镜的上方照明孔送入激发光，但这样无法消除来自显微镜片和样本的自身荧光，会产生次级干扰。采用瞬间场激发方法可避免激发光进入探测器，这种方法是由在玻璃和水界面的激发光产生全内反射实现的，因此称为全内反射荧光显微镜(TotalinternalreflectionfluorescencemicroscopeTIRFM)[14-15]。为了实现全内反射，需要大的入射角，例如玻璃-水界面的入射角要大于61°。这可以通过棱镜(prism)实现，称为prism-basedTIRFM；也可通过高数值孔径的物镜实现，此时称为objective-typeTIRFM，见图2[16]。探测器是单分子荧光检测的关键部分，常用的探测器是超敏电感偶合相机(intensitychargedcoupleddevice,ICCD)和单光子计数模式的雪崩光二极管，将其与激光共聚焦荧光显微镜和有关电子系统相组合，可进行多种形式的单分子荧光特性研究。包括单分子荧光成像，荧光光谱，荧光寿命及FRET。为了实现FRET效率最优化，需特别注意降低cross-talk现象，即供体和受体发射光互相泄漏到彼此的探测器，尤其是供体发射光的漏射。可采用带通滤波器降低此影响。一般而言，单分子FRET研究设备的主要组成包括：①激光光源，激发常用标记物Cy3的理想波长为532nm；②倒置显微镜，CSOM和objectivetypeTIRM可用60倍油浸物镜，NA=1.4,WD（工作距离）=0.15mm，prism-basedTIRM可用60倍水浸物镜，NA=1.2,WD=0.25mm；③超敏数字CCD摄象机；④其它，如样本扫描平台；荧光过滤器；棱镜；石英载玻片；雪崩光电二极管；计算机等。图3是典型的供体-受体标记的单个蛋白能量转移情形，可见供体荧光有效地转移给受体。当受体发生光漂白时，能量转移被阻断，供体自身发出荧光[17]。图2smFRET全反射荧光显微镜示意图。图3单对D-A体系标记的单个无抑制剂蛋白的能量转移过程。3.2荧光标记物用于单分子荧光研究的理想荧光标记物应有下述特点：耐光，不易发生光致漂白；具有高消光系数和高量子产率；易被激发，荧光强度波动小；体积小，对标记的宿主分子影响小。对于smFRET研究用的一对荧光探针，还要求①供、受体的激发谱有较大不同，二者的发射谱也要足够分开。但供体发射谱与受体激发谱又要有一定重叠，尽量减少供体发射的荧光漏入受体发射范围，降低激光直接激发受体的作用；②供体和受体都有相当的量子发射，保证在有FRET发生时，供、受体都有明确的强度相对变化。荧光蛋白[18-20]、有机染料[9,21]以及半导体量子点[22-23]在单分子荧光技术上均有应用。荧光蛋白具有较低的光稳定性，在单分子技术上它的应用不如有机染料广泛。有机染料由于其相对分子质量小，光稳定性强，以及多种形式的有机染料可以很容易购得(例如Cyanine系列的染料可以从GEHealthcare购得)，因此其应用最为广泛。其中，长期以来一直广泛应用的是Cyanine染料系列中的Cy3及Cy5。半导体量子点也可作为荧光的供体用于单分子荧光技术上。目前商品化的半导体量子点的直径大于20nm，远大于有机荧光染料分子(直径小于1nm)。如此大的体积，使其在smFRET中检测生物分子的构象变化上不够灵敏。另外，单官能的半导体量子点目前尚未商品化。但是JacobPiehler实验室[23]及AliceYTing实验室[24]报道了单官能的半导体量子点的制备及在单分子荧光技术上的应用。由于其光稳定性远强于荧光蛋白及有机荧光染料，半导体量子点作为一种新型的荧光探针正越来越广泛地被采用。标记的荧光团是否会影响宿主分子的生物活性？Taekjip[8]认为有机的荧光基团会有一定作用，但他们进行的有关RNA和DNA的研究，尚未发现标记的荧光基团能明显影响分子反应的动力学。在他们进行的靡蛋白酶抑制剂分子折叠-展开平衡分布的smFRET研究中，也未发现两个较大的荧光基团对分子的稳定性有影响。一般而言，应多选几个替代标记部位，根据实验要求选择对分子影响最小的部位。3.3样品的制备及单分子的检测现在有多种商品化的荧光染料，使得生物分子的标记大大简单化，如对于核酸分子的