单子叶植物CRISPR载体的构建

目录摘要..................................................................................................................1引言......................................................................................................................11.材料与方法.....................................................................................................41.1实验材料..................................................................................................41.1.1菌株...............................................................................................41.1.2体质粒载.......................................................................................41.1.2酶和试剂.......................................................................................41.1.2.1酶........................................................................................41.1.2.2抗生素................................................................................51.1.2.3生化试剂............................................................................51.2仪器设备..................................................................................................51.3实验方法..................................................................................................51.3.1酶切...............................................................................................51.3.2DNA片段补平..............................................................................61.3.3大片段去磷酸化.............................................................................1.3.4乙醇沉淀纯化DNA.....................................................................71.3.5胶回收...........................................................................................71.3.6连接.................................................................................................1.3.7KODplus高保真酶PCR反应...............................................................1.3.8检测PCR反应.............................................................................81.3.9Gateway技术..................................................................................1.3.9.1BP反应...............................................................................71.3.10大肠杆菌转化...............................................................................1.3.11质粒提取.....................................................................................92.结果与分析......................................................................................................122.1pWBVec8+Ga-b载体的酶切.................................................................122.2载体去磷酸化........................................................................................122.3载体补平................................................................................................122.4Cas9质粒的酶切....................................................................................132.5含有Cas9元件片段的补平..................................................................132.6Cas9元件片段与载体的连接................................................................132.7pWBVec8+Ga-b-CRISPR质粒检测......................................................132.8入门载体的构建....................................................................................143.讨论................................................................................................................15参考文献...........................................................................................................17致谢....................................................................................................................181集胞藻6803基因的克隆及植物转化载体的构建摘要：关键词：Gateway技术Keywords:Gatewaytechnology引言蓝藻是地球上最原始、最古老的一群植物，分布很广，主要生活在淡水中，海水中也有。蓝藻它是在地球上几乎还是绝对无氧的还原环境下，第一个利用太阳能将二氧化碳制造成有机物并释放出游离氧气的先驱生物，它对地球上的其他自养生物和异养生物的产生和演化，乃至人类的起源有着无可替代的重大意义。蓝藻藻体有单细胞体、群体和少数丝状体，为原核生物，细胞壁在电镜下分为四层，原生质体由中心质和周质组成，中心质含有DNA，无核仁和核膜结构，称为原核。周质中有很多扁平膜状的光合作用片层，呈条状有规律的排列，分布在其表面的色素有叶绿素a、藻蓝蛋白、藻红蛋白及一些黄色色素。蓝藻的光合作用产物为蓝藻淀粉和蓝藻颗粒体。周质中还有气泡。蓝藻约有150属，1500种，分布很广，从两极到赤道，从高山到海洋，到处都有它们的踪迹。根据其植物体的形态不同而分为三个纲：1、色球藻纲：包括所有单细胞体和单细胞群体种类。2、藻殖段纲：包括所有不分枝或假分枝丝状体种类及丝状群体种类。3、真枝藻纲：包括所有具真分枝的丝状体种类。。23基因组编辑就是指定点改造基因组，得到预期的生物体基因组序列从而发生遗传改变的技术，主要是进行DNA序列的敲除、插入、定点突变和组合编辑等，从而实现基因功能与调控元件的系统研究[1]。从基因组的角度出发对植物基因进行人工改造从而培育优良品种具有非常重要的意义。由于外源DNA与基因组靶基因发生同源重组效率很低，因此对植物基因组进行人工改造就显得异常困难。近年来，人们借用人工改造核酸酶来提高同源重组的效率，从而实现了对基因组的精确、定向的人工改造。目前应用于基因组编辑主要包括巨核酶技术(Meganucleases)、锌指核酸酶(ZFN)、以及TALEN核酸酶，它们已在植物基因工程中已经得到了成功的应用。然而传统基因组编辑技术存在明显不足，例如，ZFN和TALEN对于每一个新的ZFN或TALEN嵌合蛋白质都需要被改造才能识别靶序列，这就使两种基因组编辑系统广泛应用受阻。然而最近发现的CRISPR系统介导的基因组编辑技术只需要一小段引导RNA就能够识别特定的DNA[2]。而且一个新的位点只需要一个新的引导RNA，极大的简化了基因组编辑的过程，扩大了靶位点的选择。CRISPR系统也可以应用于靶向基因突变和基因修正，并且该系统也容易设计，可以实现大片段DNA缺失以及用于复合基因编辑。CRISPR-Cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats-CRISPR-associatedproteins)系统是细菌与古生菌中用来抵御外源病毒或质粒DNA入侵的获得性免疫系统。对于一个典型的CRISPR位点而言通常包含若干长度为20-50bp的保守性的正向重复序列和被其间隔开的短的非重复序列，以及位于重复上游的引导序列[3]。CRISPR系统存在三种类型，尤其以2型CRISPR系统研究较多，在2型CRISPR系统中存在Cas9核酸酶，又称CRISPR/Cas9系统。Cas9核酸酶具有改造crRNA和破坏双链DNA的双重功能[7]。位于sgRNA5‘端的20个左右的碱基决定CRISPR/Cas9系统在应用时Cas9核酸酶特异性切割的部位，主要负责决定CRISPR/Cas9系统的特异性，因此，只要改变这段