园艺植物原生质体融合技术研究进展

园艺植物原生质体融合技术研究进展11引言原生质体融合（protoplastfusion）亦称细胞融合（cellfusion）、体细胞杂交（somatichybridization）、超性杂交（Parasexualhybridization）或超性融合（Parasexualfusion），是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程[1]。植物细胞融合技术包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养，以及植株的再生和鉴定等环节。原生质体融合涉及了双亲的细胞质，它不仅可以把细胞质基因转移到全新的核背景中，也可使叶绿体基因组或线粒体基因组间重新组合。原生质体融合还可避免受精作用中的种的特异性配子识别反应，有可能打破远亲杂交中的有性不亲和界限。原生质体技术还可用于种质资源的保存、细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入等方面。原生质体融合技术起源于20世纪60年代，是基因重组技术的一部分。经过一定的理化条件处理,使外源目的基因进入受体细胞，并得以表达，以期使得受体细胞在原有性状的基础上，获得所需的新的特殊性状[2]。1953年webull首先用肤聚糖水解酶，溶菌酶得到巨大芽胞杆菌的原生质体，1960年Cocking用酶法分离出番茄根原生质体后，Nagata等首次利用烟草叶分离原生质体，经培养获得再生植株，1972年Carlson等以烟草获得了体细胞杂种[4]，1974年高国楠发现聚乙二醇（PEG）在钙离子存在的条件下能促使植物细胞原生质体融合，1975年Vardi等首次从木本植物Shamonti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织，并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株，1985年Fujimura等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株并从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进，植物细胞融合获得了巨大成功。近年来原生质体融合技术进展十分迅速，利用原生质体直接进行遗传转化的发展也引起了普遍的关注，为工农业生产实践开辟了广阔的发展前景。2原生质体融合方法早期原生质体融合方法有：硝酸钠法、高Ca+高pH法、聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)、PEG与高Ca+高pH相结合法、电融合法以及聚集微束激光法。目前，国内外实验室广泛使用的是化学法中的PEG一高Ca+高pH法和物理法中的电融合园艺植物原生质体融合技术研究进展2法。2.1电融合法20世纪80年代初开始探索使用电融合法，1979年Senda建立的电融合法是目前最流行的物理诱导融合方法[5]。其原理是利用原生质体在交变电场作用下相互接触并排列成串后，施加一次或几次高压直流电脉冲，使相互接触的原生质体质膜发生局部可逆击穿，形成融合体。该方法避免了化学药剂的毒害作用，操作简便，快速，融合同步性好，可在显微镜下观察融合的全过程，整个过程中的参数容易控制细胞电融合。近年来，已经测出数十种植物原生质体的电融合参数，并获得部分细胞杂种。这是近年来融合技术上取得的最突出的成就，有可能解决融合细胞的选择问题[6]。利用电融合法获得了菊花与智利喇叭花(茄科)的科间杂种(D．×grandiflorum×Salpiglossissinuateu)、菊花与大籽蒿的属间杂种(D．×grandiflorum×Artemisiasieversiana)、莴苣属内种间杂种(L．sativa×L．virosa、L．sativa×L．perennis、L．sativa×L．tatArica)Sherraf等[20]用电融合法诱导野生型番茄和耐盐系双单倍体土豆融合，得到再生植株，并得到介于双亲中间型的叶片和地下果实，杂种的耐盐性降低了50%。Brewer等[21]用电融合法诱导了植株矮小但可富积重金属锌和镉的Thlaspicaerulescens和植株较高大的Brassicanapus融合，并得到在含高锌和镉的土壤中存活的再生植株，使通过体细胞杂交将高积累重金属品系的基因转移到其它植物中成为可能。2.2PEG一高Ca+高pH法1974年Kao建立了聚乙二醇(PEG)法，经过不断改进建立起来的PEG一高Ca+高pH法，至今应用广泛。原生质体融合的报道多采用了该方法。但融合频率不高仍是这项技术的弱点。Kiriti等报道的融合频率为5%，Chen等报道的融合频率约4.5%。细胞融合要求新鲜的原生质体，Zhao等发现，在2-4h内已有部分细胞生出了新的细胞壁。近年来一些研究者发现，加入二甲基亚砜(DMSO)可以有效地提高融合频率[7]。孙蒙祥等报道，用PEG诱导选定的成对原生质体融合，从而使PEG融合技术更精确化，由此可能省去杂种细胞筛选步骤。利用PEG法相继获得了菊苣与向日葵属间杂种(C．intybus×Hannus)、向日葵属内种间杂种(Hannus×Hannus、Hannus×giganteus、Hannus×Hmaximiliani)、莴苣属内种间杂种(L．tatarica×L．perennis)、菊蒿属内种问杂种(Tanacetumvulare×cinerariifolium)；采用高Ca+高pH法度的聚乙二醇类媒剂技术，能够使水稻和大豆两大不同科的植物的原生质体发生融合。1999年，夏光敏等[22]用PEG法诱导普通小麦与紫外线照射的高冰草原生质体融合，产生了具有优良性状的F2代穗系。2001年Yue等[23]用PEG法将獐毛麦的耐盐性转移到普通小麦。2005年Wang等[24]采用PEG法将用IOA和紫外线分别处理的Arabidopsisthaliana(L.)和BupleurumscorzonerifoliumWilld.融合，形成科间不对称杂种并再生植株。园艺植物原生质体融合技术研究进展33原生质体融合技术的应用3.1原生质体融合在园艺植物育种中的应用植物原生质体培养和原生质体融合不仅是植物遗传改良的重要手段之一，而且原生质体也是研究植物细胞壁再生、细胞分裂和分化等一系列细胞遗传和生理过程的良好试验材料[8]。近十几年来，已经有多种植物原生质融合后得到的杂种细胞再生植株[9]，如曼陀罗×野生曼陀罗、黑心菊×金光菊、千里光×野生千里光、石竹×康乃馨、紫花野菊×菊花。应用原生质体融合技术获得体细胞杂种，可以克服其种间杂交不育的缺点，也可以将野生植物中的核控制和胞质控制的优良品质、农艺性状及抗性基因转入栽培种中。Dahon(1988)从悬浮培养高羊茅和多年生黑麦草中获得再生植株[10]。Inkkuma(1996)在暖季型草坪草的原生质体培养中，以根尖顶端分生组织为外植体，建立了日本结缕草的原生质体植株再生体系[11]。金红等利用原生质体技术得到豆科牧草沙打旺+紫花苜蓿的属间体细胞杂种[12]。胡琼等利用原生质体融合技，获得了甘蓝型油菜品种中双4号与新疆野生油菜野油18的对称性体细胞杂种[13]。在茄子育种研究中，连勇等应用原生质体融合技术，获得了茄子种间的体细胞杂种，为茄子抗病育种提供新材旧[14]。司家钢等用紫外线辐射处理胡萝卜雄蕊瓣化型不育材料的原生质体，与经15mmol/L碘乙酰胺预处理原生质体(受体)电融合，获得了33株再生植株[15]。虞秋成对野生优质工业用油植物Lfendleri的原生质体进行培养，同时利用其原生质体与普通栽培油菜品种原生质体融合。发现低剂量射线辐照处理更有利于促进原生质体融合；子叶原生质体间细胞融合频率高于下胚轴原生质体间细胞融合频率；原生质体融合细胞再生植株高60～70cm，叶片大小、茎杆粗细、花药大小介于双亲之间。3.1.1通过体细胞杂交培育抗病新材料体细胞杂交用于育种的一个重要途径是将栽培材料与相关的野生种作为亲本，经过原生质体融合、选择与再生，从而获得野生种的抗病特性。这方面研究最多的是马铃薯。马铃薯野生种Solanumbrevidens能抗多种马铃薯病害，它与马铃薯栽培种的体细胞杂种对马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒的抗性都显著高于马铃薯栽培种亲本。Helgeson得到了抗晚疫病和马铃薯卷叶病的体细胞杂种[16]。获得为作物育种提供了新的抗源材料，这在育种上显然是非常重要的。然而要培育出抗病新材料，还必须与常规的杂交育种结合起来，因为野生种不仅给予体细胞杂种以抗病的特性，同时也将园艺植物原生质体融合技术研究进展4不利的野生性状转移给体细胞杂种。对上述马铃薯体细胞杂种正在用栽培种回交的途径来培育新材料。目前通过体细胞杂交改良作物最成功的例子是中国农业科学院烟草研究所的工作,他们于1980年将普通烟草与黄花烟草的原生质体进行了融合，得到了种间体细胞杂种植株[17]。经多年回交和自交选育，终于获得了品质优良、兼抗多种病害的烟草新品系[18]。3.1.2通过体细胞杂交合成新种在种间，甚至属间的体细胞杂交中，往往可以把2个亲本的染色体组合在一起，形成杂合的二价体。如果杂种植株可育，并能稳定地遗传，就有可能形成农业上有用的新物种。Melchers等(1978)将马铃薯与番茄进行了体细胞杂交，得到了体细胞杂种植株，但没有获得预期的经济性状，这方面的探索研究仍在进行中。根据油菜属中几种植物在进化上的亲缘关系，通过体细胞杂交合成新种的研究是这方面成功的例子[19]。将白菜型油菜(Brassicacampestris)与甘兰进行体细胞杂交，成功地得到了合成种甘兰型油菜(B.napus)它具有预期的38条染色体，大部分可育，将甘兰型油菜进而与黑芥(B.nigra)的体细胞杂交也得到了一些染色体数为54条的杂种。它组合了油菜属所有的3套染色体，它们可育并结了种子。目前还难以估计这一途径在育种上的意义，但作为育种新途径的探索，仍受到许多人的重视。同时，用它来研究一些物种的起源与进化，也许具有更大的意义。3.1.3通过原生质体融合转移细胞质基因与常规的有性杂交过程不同，原生质体融合涉及了双亲的细胞质，它不仅可把细胞质基因转移到全新的核背景中，也可使叶绿体基因组和线粒体基因组重新组合，这就创造了细胞质变异的新源泉，有些可直接应用于作物育种。一般认为，异质联合中核与线粒体的相互作用可能导致雄性不育。抗除草剂阿特拉金的特性是自然群体中发生的突变性状，受叶绿体基因组的控制。Chuong将分别为胞质雄性不育与抗阿特拉金的两个单倍体油菜原生质体进行融合，建立了既为胞质雄性不育，又抗除草剂阿特拉金的油菜植株，该杂种是二倍体，用保持系授粉时能正常结籽。其叶绿体DNA的内切酶酶切图谱与抗阿特拉金的亲本一致，而线粒体DNA的内切酶酶切图谱与胞质雄性不育的亲本一致。这在烟草、马铃薯、萝卜及番茄的体细胞杂交中也有类似报道[19]。4存在的问题及研究展望虽然目前体细胞杂交还没有有效的手段将野生资源中有益性状转移到栽培种中，仍然存在体细胞杂种再生困难或再生植株寿命短等问题。但是随着植物体细胞杂交的技术的不断完善，获得杂种再生完整植株的科属范围不断扩大，植物体细胞杂交技术园艺植物原生质体融合技术研究进展5将被广泛运用。原生质体再生体系难以建立，仍是制约这项技术应用的瓶颈。比如兰科很多重要花卉植物的原生质体再生体系，至今仍是国内外研究的空白。此外，原生质体融合，植株再生频率低以及体细胞杂种育性低等问题，也严重制约着这一技术在育种中的应用。通过原生质体遗传转化途径改良作物品质、抗逆性、产量等性状，通过体细胞融合高效获得可育杂种将是今后工作的重要方向。原生质体融合技术能把亲缘关系比较远，甚至毫无关系的生物体细胞融合在一起，为远缘杂交架起了桥梁，是改造细胞遗传物质的有力手段，它不仅打破了有性杂交重组基因创造新种的界限，更重要的是扩大了遗传物质的重组范围，已经成为遗传育种的重要手段，寻找具有更高融合效率的方法有着重要意义。如灭活原生质体融合、离子束细胞融合、非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法相继提出并应用于微生物育种中，这是原生质体融合技术的新发展。相信随着科技的不断发展，原生质体融合技术在遗传育种中会占有越来越重要的地位。园艺植物原生质体融合技术研究进展65致谢从开始写作至论文定稿