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1植物组织培养农学函授专用2计划学时：2学时属累计学时：1-2学时教学目的：让学生了解组织培养的概念、类型及发展简史。教学重点：组织培养、外植体、细胞学说、细胞全能性的概念，组培的条件，组织培养的类型教学难点：组织培养、外植体、细胞学说、细胞全能性的概念教学方法：理论讲解教学过程：[A]组织教学[B]讲授新课第一章绪论第一节植物组织培养的基本概念植物组织培养是本世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的一项技术。本书所指植物组织培养具有广泛的含义。即应用无菌操作方法，培养植物的一个离体器官、组织或细胞。经各国科学家80多年的辛勤探索，现在可以说几乎所有的植物，其器官、组织或细胞都能离体培养成功。大多数还能从细胞的一部分，甚至没有细胞壁的裸露的原生质体中，再生出无数的小植株。这项技术已非常成熟，并取得了巨大的经济效益，在生物学理论探讨和生产实践上已经取得了卓越的成就。植物组织培养是生物技术的一个工作平台，近几年来由于转基因技术取得巨大成功，边境证基因植物的组织培养上了一个新的台阶。一、植物组织培养的概念指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。进行组培的条件：1、无菌：指培养基、接种工具、外植体、接种环境等处于无真菌、细菌、病毒等微生物的环境。措施：利用超净工作台接种（原理是空气过滤）、用高压蒸汽灭菌处理培养基和接种器械、用消毒灭菌剂浸泡外植体、用消毒液喷雾和紫外线照射接种室和培养室等。2、人工控制的环境：指对光照、温度、湿度、气体等条件进行人工控制。3、培养基；由水、无机盐类、有机营养成分、激素、天然物质、PH、琼脂等构成。需经过高压灭菌才能使用。34、外植体：用于离体培养的植物材料，包括植物器官、组织、细胞及原生质体等。二、植物组织培养的类型根据外植体的不同，分为：1、组织培养：常用分生组织、形成层组织、薄壁组织、韧皮部组织等。2、器官培养：常用根、茎、叶、花、果实、种子等。3、胚胎培养：常用幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。4、细胞培养；用单个或较小有细胞团培养，常用性细胞、叶肉细胞、根尖细胞等。5、原生质体培养：就是用特殊方法脱去植物细胞壁，对裸露的有生活力的原生质团进行离体培养。植物原生质体培养和细胞融合是植物细胞工程的核心技术。它克服了植物远缘杂交的不亲和性，是品种改良和创造育种亲本资源的途径。第二节植物组织培养的发展简史用插条的方式繁殖蔷薇花，以及切开马铃薯的块茎进行种植的方法，早在人们把它作为学问研究之前就实际用于花卉及部分栽培作物的营养繁殖了。而在十九世纪开始，细胞学说的开创与发展，对植物激素的研究和深入，微生物培养法等各个领域的知识的汇集才导致了今日植物组织培养的发展。植物组织培养是本世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的一项技术，经历了探索和开创、奠基、蓬勃发展三个时期。一.探索和开创时期（1）细胞学说的提出：1838～1839年Schwann和Schleiden创立了细胞学说，他们认为植物和动物都是由细胞构成的，细胞是有生命的有机体，细胞进行分裂而增多，并组建成生物体。（2）细胞全能性建立：在此理论的推动下，1898年德国植物学家G．Haberlandt设计用实验方法来检验细胞学说，于1902年发表了植物细胞培养的第一篇论文，认为可以培养植物的体细胞成为人工胚。他提出植物细胞具有全能性（totipotent）的设想，即每个细胞都具有原植物的全部遗传性，都与受精卵细胞一样，具有发育成一个完整植株的潜能。为了证明这个理论，他进行了人工培养小野芝麻、凤眼兰的叶肉组织、万年表属植物的表皮细胞等实验，虽然由于当时技术水平有限，培养没有成功，但细胞全能性理论对植物组织培养发展起到了先导作用，在技术上也是个良好的开端。1904年，E.Hanning培养了萝卜和辣根菜属的一种植物的近成熟胚，发现能使胚发育成熟。1908年，S.Simon在白杨嫩茎的培养中，观察到愈伤组织的发生和根、芽的形成。1922年，美国的Robbins和德国的Kotte分别报道获得了豌豆和玉米根尖离体培养的成功。1925年Laibach将亚麻种间杂交不能成活的胚取出培养，使杂种胚成熟，继而荫发。二、奠基时期20世纪30年代初到50年代末，是植物组织培养的发展时期。当时以法国的R．J．Gautheret和美国的P．R．White为首的科学家形成了两个植物组织培养研究中心，工作取得巨大进展。30年代最主要的发现有三点：一是植物激素——生长素的应用；二是B族维生素对植物细胞4生长的重要性被认识，并被普遍采用；三是由Cautheret和White所发展的基本方法。这三者奠定了以后各种植物组织培养的技术基础。1934年，荷兰植物学家F.W.Went发现了生长素，即吲哚乙酸。随后不少学者又相继发现吲哚丁酸、萘乙酸和2，4—D等人工合成的生长素。这是人类首先认识到的一类生长调节物质。随后发展了多种植物激素。植物激素用于植物组织培养，大大推动了研究的进展，取得许多令人振奋的结果。1937后Write首先建立了人工合成的综合培养基，证明了B族维生素对离体根生长的重要性。同年法国的Cautheret、Nobecourt培养块根和树木形成层使其生长。Write、Cautheret和Nobecourt确立的植物组织培养的基本方法，成为以后各种植物组织培养的技术基础。1941年，Overbeek等在基本培养基上附加椰乳（CM），使曼陀罗的心开期的胚，离体培养成熟。1943年，Write提出了植物细胞“全能性”学说并出版了“植物组织培养”手册，使植物组织培养开始成为一门新兴学科。1948年，Skoog和我国学者崔澄在烟草茎切段和髓培养以及器官形成研究中发现嘌呤或腺苷可以解除IAA对芽形成的抑制，并诱导成芽，从而确定嘌呤/IAA的比例是控制根和芽形成的控制条件。1955年，Miller等发现了激动素比嘌呤活力高3万倍，细胞分裂素/生长素的比值，成为控制器官发育的模式，促进了植物组织培养的发展。即细胞分裂素与生长素的比例高时产生芽，低时产生根，比值适中时可能维持原组织生长而不分化。通过先加入生长素诱导产生愈伤组织，使原组织脱分化，随后减少或取消生长素而加入细胞分裂素，即在愈伤组织上形成大量的不定芽，切割不定芽，使在含适量生长素的培养基上，不久即可生根，这是植物再生的第一种方式。1952年法国的G..Morel等将感染病毒的大丽花茎切离培养，获得去病毒(virus—free)植株。1953年W.H.Muir发明了用摇床振荡的液体培养，使烟草愈伤组织分散为单细胞或小的细胞聚集体，即细胞悬浮培养技术（suspensionculture）。以后发展成用于植物次生代谢产物大规模发酵生产的方法，如芗（人参皂甙、薯蓣皂甙、毛地黄等）、香料（茉莉香精等）、天然色素（甜菜甙色素、紫草素等）、饮料（甜菊甙等）以及调味品等等。同年，Muir还设计出看护培养技术（nurseculture），利用愈伤组织块隔着滤纸或玻璃红诱导单细胞生长、分裂，使培养获得成功。1958年J.Reinert和F.C.Steward分别发表了由胡萝卜直根髓的愈伤组织制备的单细胞，经悬浮培养产生了大量的胚状体（embryoid）和幼植株。这是植株再生的第二种方式。同年，M.Wichson和K.V.Thimann发现采用外源的细胞分裂素，可促使休眠的侧芽启动生长，形成一微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构，将嫩梢切割，可在短期内重复这一过程，嫩梢也可转到生根培养基上生根，这样可不断复制出大量的小植株。这成为植株再生的第三种方式。以上各种成就实现了Haberlandt在1902年得出的设想，植物细胞的全能性已获得大量实验证据，为各国学者所公认。在50年代所做出的成果的鼓舞下和技术基础的支持下，60年代以后，植物组织培养进入了一个新时期。三.蓬勃发展时期5进入60年代后，植物组织培养技术得到了迅猛的发展，并且与常规育种、良种繁育和遗传工程技术相结合，开始走向大规模的应用阶段，同时研究工作也更加深入和扎实。1960年，Morel采用兰属(Cymbidin)的茎尖培养，经过茎尖—原球茎—小植株的方式，使植株获得再生。这种繁殖系数极高的方法成为植株再生的第四种方式。按Morel的方法，1年内可从1个兰花茎尖繁殖出400万株具相同遗传性的健康植株。其后这一技术导致欧洲、美洲和东南亚许多国家兰花工业(orchidindustry)的兴起，获取了巨大的经济效益。与此同时，植物组织培养的研究工作也日渐深入。1960年，E.C.Cookiing采用真菌纤维素酶、果胶酶等酶制剂分离番茄的根，获得大量健康的原生质体。1971年I.Takebe等首次报道由烟草原生质体通过细胞壁再生、细胞分裂等过程再生出完整的植株，确证了植株除体细胞和生殖细胞融合，实现了体细胞杂交，获取了第一个体细胞杂种。1962年Murashige和Skoog发现了促进烟草组织快速生长的培养基成分，从而使MS培养基成为各个科属植物所广泛适用的培养基。1964年印度的S.Guha和S.C.Maheshwari培养南洋金花未成熟花药获得了单倍体植株。这一获得单倍体植株的技术由于加快了常规杂交育种工作的速度而备受人们的关注。70年代开始，我国掀起了用花药培养单倍体植物的高潮，获得了至少24种以上的花粉植株。计划学时：2学时属累计学时：3-4学时教学目的：让学生了解组织培养的优点和在农业生产上的应用教学重点：组织培养在农业生产上的应用教学难点：组织培养在农业生产上的应用教学方法：理论讲解教学过程：[A]组织教学[B]讲授新课第三节植物组培技术的应用及展望一、植物组织培养的优点1、研究材料来源单一，无性系遗传背景一致2．经济方便效率高。3．条件可控误差小培养基中各种成分，环境条件的温度飞光强光质.光周期)变温处理等，完全可控，试验处理易于安排调配，处理间误差很小。4、生长快周期短、重复性强:这是因为营养及外在条件优良，所以生长迅速。5、周年试验或生产:因为条件可控，所以不受季节限制，可全年连续试验或生产。二、植物组织培养的应用我国的植物组织培养的研究是在20世纪70年代以后迅猛发展起来的。目前药用植物组6织培养的应用主要在：快速繁殖、无病毒苗生产、选育新品种、种质资源保存、次生代谢物的生产几个领域。1快速繁殖在人工栽培植物中，有不少名贵植物，如：兰花、红豆杉、人参、云南黑节草、高山红景天等，生产周期很长，如果常规方法育种或育苗，则需要花费很长时间；另一些植物则繁殖系数小，耗种量大，严重影响了发展速度并增加了生产成本，如；贝母、番红花等；还有一些植物，如：地黄、太子参等，由于病毒为害而退化，严重影响了产量和品质；一些进口南药因种苗奇缺而影响扩大生产，如：乳香等。而药用植物生产需求大量规格统一、性状优良的苗木，这一目标可以通过组织培养手段实现。利用组织培养法每年可繁殖出几万至数百万倍的小幼苗，如：苦丁茶每株试管苗每次继代培养繁殖5倍，按平均每40天切割继代一次计算，每年可继代9次，每株苗理论上可繁殖出将近200万株苗。因此，组织培养对于因病毒病害严重影响产量和质量的药用植物、靠有性繁殖提供种子而种子发育不完善或种子成本高的药用植物、靠无性繁殖提供“种子”而无性繁殖系数低且种子需求量大的药用植物、濒危或濒危药用植物的引种驯化以保护植物资源等具有重要的科研和生产意义。2无病毒苗的生产1952年，Morel和Martin首次证实，通过茎尖分生组织的离体培养，可以获得无病毒的大丽菊植株，证实了组织培养技术对于植物脱病毒的优异作用。采用茎尖培养脱毒的原理是：在感染病毒植物体内，病毒分布并不均等。在生长点病毒含量最低，侵染的病毒使寄主代谢异常，因此造成植物生长的抑制，或形成畸变，产生皱缩、花叶、杂斑等到许多症状，导致产量大幅度下降，以及花变小，色泽暗淡，产量少等品种退化的现象。如：唐菖蒲、百合、地黄、太子参等都存在这样的问题。采用茎尖培养支病毒后，植株生长势强，抗逆能力提高，品质和产量均明显增强。例如：唐菖蒲侵染了黄