南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆

绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆南方医科大学学院摘要本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。关键词：绿色荧光蛋白克隆表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆实验日期2015-~2015-实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤二、实验原理1.pEGFP-N1质粒2.T载体三、材料与方法：1.实验材料：质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGAR——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验试剂：即用型蓝白T载体（pMD18-Tvectorcloningkit）快速DNA连接试剂盒限制性内切酶：EcoRI（Fermentas）Axygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等2.方法分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子四、实验具体流程1.获取外源基因1)碱裂解法提取质粒使用Axygen质粒提取试剂盒离心1300rpm,1min瞬时离心漩涡震荡颠倒数次悬浮沉淀颠倒数次离心放置3-5min13000rpm,1min离心离心13000rpm,1min13000rpm,1min空柱离心离心13000rpm,2min13000rpm,1min2)PCR扩增目的基因GFP取0.2mlPCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：H2O6l质粒DNA（pEGFP-N1）2l引物GFP1(10M)1l引物GFP2(10M)1lPremixTaq10l总体积20l加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。PCE参数设置：①94℃预变性5分钟后开始以下循环②94℃30秒56℃30秒30循环72℃1分钟③72℃7分钟④4℃保温菌液弃上清彻底弃上清加250μl溶液S1加250μl溶液S2加350μl溶液S3离心13000rpm,10min取上清600μl加到吸附柱中弃滤液，加入600μl洗涤液W弃滤液，加入600μl洗涤液W弃滤液放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加40μl洗脱液PCR扩增/-20℃保存备用3)琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒凝胶准备→胶床准备→铺胶→静置→胶床置于电泳槽中→加电泳缓冲液→拔梳子→上样（1lPCR产物，6lloadingbuffer混合点样）→点marker→电泳→取出凝胶→拍照2.构建重组DNA使用即用型蓝白T载体和快速DNA连接试剂盒。按下表加入试剂：为了检验转化是否成功，设置对照组实验实验组①对照组②即用型蓝白T载体1l1lPCR扩增产物1l—ControlInsertDNA—1l快速连接缓冲液(2X)5l5l超纯水-ddH2O2.5l2.5lRapidT4DNAligase0.5l0.5l总体积10l10l添加完成后，冰箱内16℃反应45分钟3.重组DNA的转化1)预先制备好感受态细胞。2)转化DNA，为了检验转化是否成功，设置对照组实验实验组：10lPCR产物/蓝白T载体连接产物+100l感受态细胞阳性对照组：10lControlInsertDNA/蓝白T载体连接产物+100l感受态细胞阴性对照组：10l无菌双蒸水+100l感受态细胞步骤：（分别制作3组）将10lDNA和100l的感受态细胞加入试管中→冰浴30min→42℃水浴精确90s→迅速转移至冰浴冷却1-2min→加入800lLB培养基→恒温培养箱中37℃培养45min3)检测重组DNA：涂布平板筛选步骤：取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素（Amp、X-gal、IPTG）的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟，倒置平皿37℃培养过夜。4.重组DNA的筛选培养的菌落在筛选培养基中，白色的菌落含有重组体pUC18，蓝色菌落则没有或只有载体pUC18。挑选白色单菌落扩大培养：用接种棒在白色单菌落上挑取菌落，接种于4mlLB/Amp+培养液中，37℃震荡培养过夜。5.重组DNA的鉴定从扩大培养的菌液中提取重组质粒DNA，再进行限制性内切酶酶切，经行琼脂糖凝胶水平电泳。进行对照实验。步骤：12000rpm250l250l1min溶液S1裂解液S2颠倒混匀4-6次350l温和的颠倒混匀6-8次12000rmp室温静置3~5min中和液S3直到出现白色絮状沉淀10min12000rmp600l洗涤液W600l洗涤液W30s12000rpm30s12000rpm30s10000rpm50l室温静置12000rpm2min洗脱液1min1min2l10×BufferR10LH2O6l2lEcoRI扩大培养的菌液菌体沉淀剧烈震荡弃滤液空柱弃滤液取吸附柱至另一新EP管收集洗脱液备用弃滤液取600l上清于吸附柱管洁净离心管混合后37℃水浴1~16h取5l加buffer混合取5l，加1lloadingbuffer混合电泳五、结果与讨论：最后插入质粒中的DNA片段应为740bp，重组质粒大小应为3038bp+740bp=3778bp实验结果现象与讨论碱裂法提取质粒pEGFP-N1质粒大小为4.7kb，电泳显示光带与marker5k相近，说明质粒提取较成功。电泳显示出两条带，可能原因：1、加入S2时颠倒力度过大造成DNA断裂。2、加入S2变形时间过长。3、加入S3复性时间过长。4、提取的质粒不够纯净。PCR扩增目的基因只出现两条带，其中有接近750bp的光带，说明目的基因在PCR扩增中得到扩增。重组DNA的筛选实验组培养基中：1是蓝色菌落2是白色菌落阳性对照组培养基中只有白色菌落阴性对照组培养基中无菌落说明重组DNA较为成功。12500020005000750重组DNA的鉴定1是酶切DNA2是提取的质粒DNA当天实验使用的marker为2000bp。两个光带均亮度微弱，且均大于2000bp，酶切DNA没有出现740bp的光带。总结：在PCR扩增中，虽然有接近750bp的光带，但亮度微弱，说明在实验过程中，DNA破坏严重，所以到后面实验中，重组成功的细菌，量不多，光带亮度都微弱。而在实验过程中，我们在需要颠倒的步骤发现我们颠倒完后的管中出现气泡，这是其他小组没有的。所以经过总结，认为我们加入溶液时颠倒力度过大，导致质粒断裂，所以显示的光带亮度都比其他小组的暗。最后鉴定中酶切DNA没有出现740bp的光带，可能原因也与上面所说的有关，在操作时我们也出现了气泡，认为是颠倒力度过大导致目的基因断裂。1250002000