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2010级生物技术专业微生物技术方向《微生物遗传育种》复习思考题《微生物遗传育种》复习思考题01绪论1、工业微生物菌种应具有哪些基本特征？非致病性；适合大规模培养工艺要求；利于规模化产品加工工艺；具有相对稳定的遗传性能和生产性状；形成具有商业价值的产品或具有商业应用价值。2、简述工业微生物遗传育种的分类。天然菌种（nativestrain）：通过自然筛选和分离获得的工业菌种；诱变菌种（mutagenizedstrain）：通过物理、化学等诱变剂在实验室人工诱变自然筛选与分离的菌株所获得产量或/和性状改善的工业菌种；重组菌种（recombinantstrain）是通过遗传重组技术对菌种进行定向遗传改良获得的工业菌种；遗传修饰生物体（geneticmodificationorganisms,GMOs）：经外源基因导入并因此发生遗传整合和性状改变的生物体。3、试从微生物遗传学的不同角度阐述你对微生物多样性的认识。一、微生物物种的多样性;二、微生物遗传的多样性;三、微生物代谢的多样性;四、微生物的生态多样性;五、微生物利用的广泛性02第四章工业微生物育种诱变剂1、什么是诱变剂？可分为哪几种类型？诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质.可以分为三类：物理诱变剂；化学诱变剂：一类能对DNA起作用，改变DNA结构，并引起遗传变异的化学物质；生物诱变剂：采用某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株时，常常发现伴随着出现抗生素产量明显提高的抗性突变株。因此，可以认为这些溶源性噬菌体是一种生物诱变剂。2、什么是突变？突变的表现型有哪些？基因突变的特点有哪些？突变，从广义上讲，除了转化、转导、接合等遗传物质的传递和重组引起生物变异以外，任何表型上可遗传的突变都属突变范围，如染色体整倍性和非整倍性的变化及染色体结构上的畸变等都包括在内。1、形态突变型，是一种可见突变，它包括微生物菌落形态变化，如菌落形状大小、颜色、表面结构等；2、生化突变型，；3、条件致死突变型；4、致死突变型；5、抗性突变型；6、营养缺陷型；普遍性；随机性（基因突变可以发生在生物个体发育的任何时期和生物体的任何细胞。突变发生的时期越早，表现突变的部分越多，突变发生的时期越晚，表现突变的部分越少。）；突变率低；多数有害；不定向性（一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等位基因。3、突变后其基因型是否会很快表现？为什么？变基因的出现并不意味着突变表型的出现，表型的改变落后于基因型的改变，即表型延迟，微生物通过自发突变或人工诱变而产生新的基因型个体所表现出来的遗传特性不能在当代出现，其表型的出现必须经过2代以上的繁殖复制。表现延迟的原因有：1、与诱变剂性质和细胞壁结构组成有关；2、当突变发生在多核细胞中的某一个核，该细胞就成为杂核细胞了；3、原有基因产物的影响。（产生原因：①分离性迟延现象②生理性迟延现象）4、物理诱变剂主要有哪几类？请举例？物理诱变剂包括：紫外线，X射线，γ射线，快中子，α射线，β射线，微波，超声波，电磁波，激光射线和宇宙射线等5、化学诱变剂主要有几大类？碱基类似物；烷化剂；脱氨剂；移码诱变剂；羟化剂；金属盐类；其他化学诱变剂第1页共10页2010级生物技术专业微生物技术方向《微生物遗传育种》复习思考题6、使用化学诱变剂时需要注意什么？、在进行化学诱变处理时，控制使用剂量要以诱变效应大，而副反应小为原则。处理时的温度对诱变效应也有一定影响。绝大多数化学诱变剂都具有毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，不能直接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全防止污染环境，造成公害。7、根据你所学的诱发突变的知识，你认为能否找到一种仅仅对某一基因具有特异性诱变作用的化学诱变剂？为什么？不能找到具有特异性诱变作用的化学诱变剂，因为对于一般的化学诱变剂：碱基类似物、碱基修饰剂、移码突变剂，均不具有特异性。诱变的特异性是靠识别碱基对来进行的，而任一个基因都不可能有完全特异的碱基对供识别。突变是随机性的。因为从分子生物学的角度来看，所有的基因都是存在于DNA双链中，基因的信息都存在于由ATCG碱基对的排列顺序中。即使有某些物质可以特异的识别某几个碱基的排列顺序，但这种排列也存在于其他基因之中，诱变是在整个基因组范围内发生的。所以从现有的科研水平来看，不存在有特异性的理化诱变剂。现在对基因的诱变可以通过传统的遗传学方法实现，可以构建带有诱变位点的基因载体，转入生物体中，达到特异诱变的目的。8、表现延迟：微生物通过自发突变或人工诱变而产生新的基因型个体所表现出来的遗传特性不能在当代出现，其表型的出现必须经过2代以上的繁殖复制。03第五章菌种分离筛选1、工业微生物的来源？1、向菌种保藏机构索取有关菌株，从中筛选所需菌株；2、由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选；3、从一些发酵制品中分离目的菌株。2、从土壤中筛选微生物时，采样应该注意一些什么问题？根据土壤特点：1、土壤有机质含量和通气情况；2、土壤酸碱度和植被状况；3、地理条件；4、季节条件；采样方法：用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5-25cm处的土样10-25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。3、什么叫富集培养？是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。4、纯种分离的方法有哪些？简述菌种分离和筛选的步骤。纯种分离通常采用梯度稀释涂布法和划线法。划线法是用接种针挑取微生物样品在培养基上直接划线（一般采用梯度划线法），培养后获得单菌落。划线法简便、快速，但所得到的单菌落不一定是纯种（可采用多次转接划线加以弥补）。稀释法是先将样品经无菌水或灭菌生理盐水梯度稀释后，再涂布到固体培养基上，培养后获得单菌落。稀释法使微生物样品分散更加均匀，获得纯种的概率更大。通过控制营养和培养条件进行纯种分离：一般都采用筛选性平板辅以筛选性培养条件（1）控制分离培养基中的营养成分（碳氮源）（2）控制培养基的pH值（采用缓冲体系）（3）控制培养温度（嗜热性、大类特性如细菌35，霉菌27度）（4）供氧条件的控制（厌好氧）利用生化反应进行分离（初步分离）：根据目的微生物的特殊生理特性或其代谢产物的生化反应进行设计。常用方法：（1）透明圈法（培养基浑浊）（2）变色圈法（指示剂或显色剂）（3）生长圈法（采用营养缺陷菌作为指示）（4）抑菌圈法（抗生素敏感菌作为指示）可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。第2页共10页2010级生物技术专业微生物技术方向《微生物遗传育种》复习思考题04第六章微生物诱变育种1、用野生型的大肠杆菌为出发菌株，可用哪种诱变剂怎样进行诱变得到Leu-突变株，如何检出和鉴定该突变株？1。先要获得野生型大肠杆菌的纯培养物2。诱变：可以选择各种诱变法，如紫外线诱变法，将一定浓度的菌液（可分成好几等分分别做实验）放在一定强度的紫外灯下照射，那分成的几等分可以分别照射10S，20S，30S，40S，50S，60S，注意，菌液不可太稀太浓，这个操作应该在黑暗的条件下进行，只允许有紫外光，以免光修复造成突变失败。3.培养：将上述菌种分别涂抹在配好的完全培养基上（牛肉膏-蛋白胨培养基），倒置培养过夜4，筛选：配置好基本培养基，再往上面添加一定浓度的氨基酸营养液，除了不要添加你说要得到的营养缺陷的那种氨基酸，必需氨基酸都要添加，再用影印法将3中的菌落印到这些培养基上，倒置培养过夜。5。挑取：直接挑取4中培养基上的菌落，就是你要找的氨基酸营养缺陷突变菌株在2中，之所以要分成好几份做，再以不同时间长短去照射，是为了加大筛选的效率时间过短，可能得不到想要的突变菌种，而时间过长，菌株全死，也得不到想要的菌株，所以这样做也可以算是一个试验性的步骤！2、诱变育种工作中如何制备菌悬液？在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞的均匀悬液状态。原因：1、分散状态的单细胞可以均匀地接触诱变剂；2、可避免长出不纯菌落。菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞用生理盐水或缓冲液制备而成，其质量将直接影响诱变效果。1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮；2、菌悬液制备方法：细菌经20h-24h培养的新鲜斜面，移接到盛有基本培养基的三角瓶中，于35-37℃振荡培养到对数期，在于6℃培养1h使之同步生长，然后加入一定密度的嘧啶、嘌呤或酵母膏，继续振荡培养20-60min。置于低温10min，离心洗涤，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min,令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。3、根据突变的光复活修复作用、原理，你认为在进行紫外线诱变处理时，应注意什么?为了使被诱变的细胞能均匀地受到紫外线照射，你将如何做？①必须在暗室或红光下进行，并且不能马上进行光照射②照射距离要合适，不能太远，否则达不到诱变作用，也不能太近，否则菌体会死③照射时间要恰当④紫外灯的功能要适宜。在紫外线照射时，盛菌液的培养皿应置于磁力搅拌器上，边照射边搅拌使细胞能均匀受到紫外线照射。4、紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体对微生物有何影响？哪些修复系统可对此进行修复，其结果如何？微生物在正常情况下进行DNA复制时，首先DNA双链解开成为单链，然后两条单链各自与细胞内游离的碱基互补配对形成新链。如果此时双链之间有嘧啶二聚体存在，则因二聚体的交联作用，阻碍双链分开，复制到此处就无法进行下去，造成DNA异常状态。如果在一条单链上出现嘧啶二聚体，则会影响复制过程碱基的正常配对。在正常情况下T与A配对，若二聚体形成，就要破坏A的正常掺入，复制就会在这一点突变停止或错误进行，以致在新形成的链上有了一个改变了的碱基序列。有光修复、切补修复、重组修复、SOS修复系统。还有聚合酶的校正作用。第3页共10页2010级生物技术专业微生物技术方向《微生物遗传育种》复习思考题光修复、是一种高度专一的修复方式，只作用由紫外线引起的DNA嘧啶二聚体的修复切补修复、发生在DNA复制之前，是对模板的修复，如大肠杆菌的Uvr修复系统，负责切除大量的胸腺嘧啶二聚体。重组修复、不将损伤碱基除去，而是通过复制后，经染色体交换，使子链上的空隙部位不再正对T=T，而是面对正常的单链。其中Rec系统负责消除那些没有被切除修复系统所切除的T=T可能造成的可怕的后果。SOS修复系统、松懈DNA复制校对系统，允许新生DNA链越过T=T而延伸，不去管双螺旋结构的变形。导致错误的碱基出现在生长链的任何位置，数量太大，错配修复和切除修复系统纠正一些，仍留有很多错配碱基，从而造成突变。光修复、切补修复和聚合酶修复都是修复模板链。而重组修复是形成一条新的模板链，SOS是产生连续的子链。SOS修复是唯一导致突变的修复，其余的修复机制都是将DNA损伤恢复到损伤前的状态或产生与亲本完全相同的子代DNA。5、某人将一细菌培养物用紫外线照射后，立即涂布在加有链霉素（Str）的平板上，放在有光条件下培养，从中筛选Str抗性突变株，结果没有长出Str抗性菌落，试分析失败的原因？1、紫外线诱变后见光培养，造成光修复，使得突变率大大下降，以致选不出str抗性菌株；2、紫外线的照射后可能根本没有产生抗str的突变。6、紫外线诱变育种的作用机制。紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/mL左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个/mL。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。7、何为基本、完全、补充培养基？⑴基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株