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1土壤中分解尿素的细菌的分离与激素1、尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用。2、CO(NH2)2+H2O细菌脲酶CO2+2NH3一、研究思路（一）筛选菌株1、实例----耐高温DNA聚合酶的寻找美国科学家布鲁克（1966年）--在美国黄石公园的一个热泉中发现耐热细菌。这说明寻找菌株要到期相应的中寻找。2、实验室中微生物的筛选原理人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。3、筛选菌株的培养基KH2PO41.4gNaHPO42.1gMgSO4H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。4、选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。（二）、统计菌落数目：1、活体计数法----稀释涂布平板法（1）操作方法：稀释涂布平板→统计菌落数。（2）原理：1个菌落→1个活菌。（3）统计原则①、选30∼300个菌落的平板统计。②、每个稀释度取3个平板取其平均值。（4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目，因此统计结果一般用表示。每克样品中的菌株数=。C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。2、显微镜直接计数（三）设置对照1、设置对照的目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。2、对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。满足该条件的称为对照组，未满足该条件的称为实验组。实验组：对照组：设置对照----同等条件下，培养空白培养基。思考：1、该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？碳源：葡萄糖、尿素氮源：2、此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？能。只有产生脲酶的细菌才能利用作为氮源而生存。思考：1、1个菌落1个活菌。2、统计的菌落数实际活的细菌数。3、用稀释涂布平板法一定要重复实验，一般至少要涂布3个平板。4、重复实验结果中小于30菌落的不用。菌落计数配制土壤溶液系列稀释涂布平板与培养2四、实验设计（一）土壤取样1、土壤是天然培养基----其微生物数量、种类。2、土壤取样：（1）取样的位置：土壤中70∼90％是细菌。在富含有机质的土壤层的3∼8cm处中分布着绝大多数的细菌。（2）取样要求：铲去表层土。（1）、测细菌数：一般用104、105、106稀释液。（二）样品稀释（2）、测放线菌：一般用103、104、105稀释液。原则：确保平板上的菌落数在之间。（3）、测真菌数：一般用102、103、104稀释液。1、接种：用适当的稀释液作涂布平板2、培养：细菌：30∼37℃，1∼2d；（三）微生物的培养与观察放线菌:25∼28℃,5∼7d；霉菌:25∼28℃,3∼4d。3、观察：a.每24h统计一次菌落数目。原因：不同种类的微生物，往往需不同的培养温度和培养时间，每隔24h统计1次菌落数目，选取菌落数目稳定时记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。b.以“稳定菌落”为观察对象。原因：不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。（四）鉴定酚红鉴别培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→结论：该细菌能分解尿素。注意：1、在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。2、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。五、实验的具体操作（一）、无菌操作1、土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。2、制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。3、样品的稀释：注意①①、、为为了了保保证证结结果果准准确确，，一一般般选选择择菌菌落落数数在在3300————330000的的平平板板上上进进行行计计数数。。②②、、为为使使结结果果接接近近真真实实值值可可将将同同一一稀稀释释度度加加到到三三个个或或三三个个以以上上的的平平皿皿中中，，经经涂涂布布，，培培养养计计算算出出菌菌落落平平均均数数。。③③、、统统计计的的菌菌落落往往往往比比活活菌菌的的实实际际数数目目低低。。这这是是因因为为两两个个或或多多个个细细胞胞连连在在一一起起时时，，平平板板上上观观察察到到的的只只是是一一个个菌菌落落。。因因此此，，统统计计结结果果一一般般用用菌菌落落数数而而不不是是活活菌菌数数来来表表示示。。④④、、涂涂布布平平板板法法所所选选择择倒倒平平板板的的稀稀释释度度很很重重要要，，一一般般以以三三个个稀稀释释度度中中的的第第二二个个稀稀释释度度倒倒平平板板所所出出现现的的平平均均菌菌落落数数在在5500个个左左右右为为最最好好。。3（1）、应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。（2）、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。（3）、分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。（4）、如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。（二）、做好标记1、实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。2、装系列稀释菌的试管在试管架上最好由低到高放置。（三）、制定计划六六、、结结果果分分析析与与评评价价11..通通过过对对照照实实验验，，若若培培养养物物有有杂杂菌菌污污染染，，菌菌落落数数偏偏高高；；若若培培养养物物混混入入其其他他氮氮源源，，则则菌菌落落形形态态多多样样，，菌菌落落数数偏偏高高，，难难以以选选择择出出分分解解尿尿素素的的微微生生物物。。22..提提示示：：选选择择每每个个平平板板上上长长有有3300————330000个个菌菌落落的的稀稀释释倍倍计计算算每每克克样样品品的的菌菌数数最最合合适适。。同同一一稀稀释释倍倍数数的的三三个个重重复复的的菌菌落落数数不不能能相相差差悬悬殊殊，，如如相相差差较较大大，，表表示示实实验验不不精精确确。。注意：测测定定饮饮水水中中大大肠肠杆杆菌菌数数量量的的方方法法是是将将一一定定体体积积的的水水用用细细菌菌过过滤滤器器过过滤滤后后，，将将滤滤膜膜放放到到伊伊红红美美蓝蓝鉴鉴别别性性培培养养基基上上培培养养，，大大肠肠杆杆菌菌菌菌落落呈呈现现黑黑色色，，通通过过记记述述得得出出水水样样中中大大肠肠杆杆菌菌的的数数量量。。例1：土壤中的细菌能分解尿素，是因为它们能合成一种()A．尿素酶B．脲酶C．蛋白酶D．肽酶例2：在培养基中加入尿素(惟一氮源)，以分离出能分解尿素的细菌，这种加入尿素的培养基在功能上属于()A．选择培养基B．固体培养基C．液体培养基D．半固体培养基例3：实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂平板上画3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触)，将平板置于37℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析，以下叙述不．正确的是()A．链霉素能阻止结核菌的生长B．链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效C．链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效D．链霉素可以用于治疗伤寒病人例4：测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释，其原因是()A．细菌个体小，真菌个体大B．细菌易稀释，真菌不易稀释C．细菌在土壤中数量比真菌多D．随机的，没有原因例5：用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是()A．未接种的选择培养基B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基D．接种了的选择培养基例6：通常用来作为菌种鉴定的重要依据是()A．菌落B．细菌形态C．细菌体积D．细菌结构例7：下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是()A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水4B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、水C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、水D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水例8：在涂布平板操作时错误的是()A．将涂布器在酒精灯火焰上灼烧，直到烧红B．取少量菌液滴加在培养基表面C．将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃待酒精燃尽后，冷却8s～10s再用D．涂布时可转动培养皿，使涂布均匀例9：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养能分解尿素的细菌后，指示剂的颜色是()A．蓝色B．红色C．黑色D．棕色例10：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时又能抑制或者阻止其他种类微生物生长的培养基称做()A．鉴别培养基B．加富培养基C．选择培养基D．基础培养基例11：分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是()①加尿素②不加尿素③加琼脂④不加琼脂⑤加葡萄糖⑥不加葡萄糖⑦加硝酸盐⑧不加硝酸盐A．①③⑤⑦B．②④⑥⑧C．①③⑤⑧D．①④⑥⑦例12：在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找，下列不．属于厌氧细菌生存环境的是()A．土壤深层B．人或动物体内寄生C．真空D．池塘淤泥例13：下列是关于检测土壤中细菌总数实验操作的叙述，其中错误的是()A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上C．将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24～48小时D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数例14：可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是()A．以尿素为惟一氮源的培养基中加入二苯胺试剂B．以尿素为惟一氮源的培养基中加入酚红指示剂C．以尿素为惟一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂D．以尿素为惟一氮源的培养基中加入双缩脲试剂例15：在做土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验时，甲组实验用氮源只含尿素的培养基，乙组实验用氮源除尿素外还含硝酸盐的培养基，其他成分都相同，在相同条件下操作，培养与观察，则乙组实验属于()A．空白对照B．标准对照C．相互对照D．条件对照