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土壤微生物的分离与鉴定组员：阚能涛，户红通，郭晓辉，耿静，孔桂慧，兰欣玉关键词：土壤微生物，分离鉴定，生理生化，实验摘要：土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。根际微生物与植物的关系特别密切，不同的土壤和植物对根际微生物产生显著影响，而不同的根际微生物由于其生理活性和代谢产物的不同，也将对土壤肥力和植物营养产生积极或消极的作用。土壤微生物不仅对土壤的肥力和土壤营养元素的转化起着重要作用，而且对于进入土壤中的农药及其他有机污染物的自净、有毒金属及其化合物在土壤环境中的迁移转化等都起着极为重要的作用。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10cm～30cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌数减少。土壤中微生物以细菌数量最多，为几百万个/克土至几亿个/克土，有各种生理类群，营养类型多属异养型，鉴别染色多为革兰氏阳性。放线菌含量为几万个/克土至几百万个/克土，但其生物量不比细菌低，因为菌丝体积较大。土壤中真菌含量为几千个/克土至几十万个/克土，而其生物量常比细菌的大。酸性土壤中真菌较多。藻类在土壤中的含量不及微生物总数的1％，生长在潮湿土壤的表层。原生动物在富含有机质的土壤中较多。通过土壤微生物的分离与计数及划线纯化，涂布分离长出的单菌落，须经划线纯化，再转斜面培养后保藏备用。涂布分离细菌的平板，温箱培养2d～3d后，于室温下放置3d或2d，使菌落性状表现较充分，然后挑取各单菌落的部分培养物，在预先制备好的平板上划线纯化。达到分离纯化认识土壤中微生物的目的，并掌握各种相关实验操作技术。实验原理：(一)对土壤中微生物的分离筛选及鉴定从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程成为微生物的分离与纯化，常用的方法有简易的细胞挑取法和平板分离法。其中平板分离法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化，奇迹般原理包括两个方面：（1）逊则适合于待分离微生物的生长条件如营养，酸碱度，温度或氧等要求或加入某种抑制剂造成只有利于该种微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。（2）微生物在固体培养基上生长形成单个的菌落可以是由一个细胞生长繁殖形成的集合体。因而可以通过挑取单个菌落而获得一种纯培养，或去掉那个菌落的方法可由稀释涂布和平板划线等技术完成。土壤是微生物生活的大本营，它所含有的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的微生物菌株。二菌株的鉴定的生理生化实验糖发酵与氧化试验在细菌的分类鉴定中，糖类发酵与氧化测定是一项重要依据。特别是对细菌的鉴定尤为重要。常用的发酵与氧化的糖类包括单糖，双糖，多糖三类：如葡萄糖，蔗糖，淀粉等。醇类包括五元醇，六元醇;如到金盏花醇，甘露醇等；糖苷类主要包括有水杨苷等。绝大多数细菌都能利用糖类作为能源和碳源，但由于不同的菌类存在酶类差异，已而对糖类发酵与氧化的能力就有所不同。有的能利用这种而不能利用那种，有的正好相反；有的在糖类发酵与氧化代谢中能分解糖类，产酸产气，有的则只能产酸不能产气。酸产生与否，以及时发酵类型产酸还是氧化类型产酸，可以由预先加在培养基中的指示剂（溴百里酚蓝水溶液）呈现出来。这样把接好菌种的培养基放在厌氧或好样的条件下培养，培养基由绿色变为黄色为产酸，是否产气是通过观察培养基中是否产生气泡或培养基断裂来测定，如产生断裂或有气泡证明由气体存在。过氧化氢酶测定乳酸菌和许多厌氧菌与其他细菌区分的主要依据是测定有无过氧化氢酶。过氧化氢酶又称接触酶，它能把过氧化氢分解为水和氧气，氧分子变做气泡跑出来，则为过氧化氢酶阳性。乳酸菌和许多厌氧菌在过氧化氢试验中呈阴性。细胞色素氧化酶测定细胞色素氧化酶是氧化酶中的一种，有时人们习惯的把细胞色素氧化酶称为氧化酶，所以在细菌分类鉴定中所说的氧化酶就是指细胞色素氧化酶。细胞色素氧化酶在右分子氧和细胞色素C存在时，可氧化二甲基对本撑二胺(氨基二甲基苯胺)，使之呈现玫瑰红到暗红色，在此基础上，还能和a-苯酚结合生成吲哚酚蓝，而出现蓝色。实验目的：土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离并纯化细菌。1、设计实验方案，分离目的菌，并通过后续实验做出初步鉴定。学习从样品中分离、纯化出所需菌株。掌握倒平板的技术和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。2、学习并掌握过氧化氢酶测定、细胞色素氧化酶测定和糖发酵与氧化试验的实验原理及其操作方法。3、复习显微镜底倍镜和高倍镜的使用技术，复习油浸系物镜的基本原理，复习其使用方法。4、明确培养基的配制原理。复习配制培养基的一般方法和步骤。复习消毒和灭菌的原理，复习各种灭菌方法的操作步骤。5、复习、掌握细菌稀释分离、划线分离等技术。复习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌的培养条件和培养时间。复习平板菌落计数法。6、复习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。复习鞭毛染色、革兰氏染色的基本原理和操作方法。实验过程：实验器材：1、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基2、试剂：革兰氏染色液、5%孔雀绿水溶液、0.5%番红、甘油、灭菌水3、仪器或其他：三角瓶、试管、接种环、接种针、载玻片、酒精灯、涂布棒、移液枪、显微镜、平皿、木夹子等。4、样品：生命科学院试验田中土壤实验步骤：一、分离与纯化1.准备将内装90ml的蒸馏水和玻璃珠若干的三角瓶、已配好的培养基、涂布棒、试管（内装9ml蒸馏水）若干、平皿若干放入高压锅高温灭菌。2.稀释将土壤样品10g加入90ml灭菌水中振荡20分钟，形成土壤悬浊液，取1ml加入装有9ml灭菌水试管中振荡形成10-2稀释，依次将土壤样品稀释10-3、10-4、10-5、10-6、10-73.涂布平板将10-5、10-6、10-7的稀释样品分别涂布到已制好的固体培养基平板上，每种涂3个平板。4.培养将平板置于37。C恒温培养三天。5.分离从平板中挑取单个菌落进行平板划线分离培养，培养2天，共选了4种菌。6.纯化将划线长出的菌接种于已准备好的固体斜面培养基中。培养2天。7.镜检对平板中的4种菌分别进行美蓝染色、革兰氏染色、芽孢染色，放在显微镜下观察，并记录结果。8.保种将长出菌的斜面放入冰箱中保存。二、生理生化实验（一）糖类发酵与氧化实验一、器具或材料试管、接种针、恒温箱等糖类发酵与氧化实验培养基（半固体）二、操作步骤1、接种：以移接18—24小时待鉴定的菌用接种针穿刺接种。接4支，其中2支用灭菌的凡士林或石蜡洋菜上封盖，以隔绝空气为闭管，另2支不封为开管，同时要有不接种的闭管作对照。2、培养：置于37度恒温箱中，培养8—16个小时，1天、3天和7天3、观察：在上述培养时间内观察试管中指示剂的变化情况三、结果在8小时、16小时检查，若培养基柱上部变黄，下部仍为绿色，则证明为氧化型，全部变黄或下部变黄上部为绿，则为发酵型。（二）过氧化酶测定一、器具与材料试管、培养皿、小滴管、接种环、恒温箱等，3%过氧化氢溶液二、操作步骤1、接种：将鉴定菌接种于适宜的斜面或固体平板上2、培养：适温培养18—24小时3、测定：取3%过氧化氢0.5毫升，滴加到不含血红素或红血球的琼脂培养物上，也可取一环培养18—24小时的菌苔涂在干净的载玻片上，然后滴一滴3%的过氧化氢。三、结果培养物出现气泡为阳性反应，无气泡为阴性反应（三）细胞色素氧化酶测定一、器具与材料新华一号滤纸、培养皿、白金丝（或火柴棒）等。牛肉膏蛋白胨培养基，1%盐酸二甲基对苯撑二胺（或盐酸对氨基二甲基苯胺）溶液，1%α—萘酚乙醇溶液二、操作步骤Ⅰ、方法一1、在干净培养皿里放一张滤纸（或滤纸条）2、用白金丝或火柴棒（切勿用含铁物质，因遇铁后出现假阳性）取培养18—24小时的鉴定菌苔粘在滤纸上。3、在滤纸上菌苔处，加上一滴1%盐酸二甲基对苯撑二胺（或盐酸对氨基二甲基苯胺）溶液，进行观察。Ⅱ、方法二1、用1%盐酸二甲基对苯撑二胺（或盐酸对氨基二甲基苯胺）溶液湿润滤纸2、再滴加约等量的1%α萘酚乙醇溶液3、用白金丝接种环或火柴棒榨取约鉴定菌菌苔涂抹在上述滤纸上，进行观察。三、结果方法一：在10秒钟内涂抹的菌苔呈现红色者为阳性；10—60秒钟呈现红色者延迟反应，也为阳性；60秒钟以上呈现红色者都不计，按阴性处理。方法二：出现兰色者为阳性，出现变色的时间要求同上四、查伯杰氏手册根据菌落形态、染色性质及生理生化性质查分离出的菌为哪几种菌。实验结果记录：1、菌落特征项目菌号颜色透明度形态湿润度边缘隆起程度1土黄色不透明圆形湿润整齐扁平2土黄色不透明圆形湿润整齐扁平3土黄色不透明圆形湿润整齐扁平4灰白色半透明不规则湿润不整齐隆起2、镜检结果项目菌号形状状态革兰氏染色芽孢1杆状链生G-端生2杆状散乱G-无3球妆成片G+无4杆状链生G+端生3、生理生化实验结果（1）糖类发酵与氧化实验项目菌号封管不封管产气培养基柱上部培养基柱下部培养基柱上部培养基柱下部1黄色黄色绿色绿色无2绿色黄色绿色绿色无3绿色黄色黄色绿色无4绿色黄色黄色黄色无空白绿色绿色无无根据封管判断：1、2、3、4号菌均为发酵型，且均不产气。（2）过氧化氢酶测定菌号结果1234＋－＋＋结论：1、3、4号菌有过氧化氢酶，2号菌无过氧化氢酶（3）细胞色素氧化酶测定菌号结果1234＋＋－－结论：1、2号菌含氧化酶，3、4号菌不含氧化酶4、查伯杰氏手册结果：1号菌：细胞杆状，链生，革兰氏反应阴性，有芽孢，端生，代谢为发酵型，过氧化氢酶测定为阳性，氧化酶测定为阳性。查伯杰氏手册估计为杆菌科芽孢杆菌属。2号菌：细胞杆状，革兰氏反应阴性，菌散乱不成片生长，代谢为发酵型，产酸不产气，过氧化氢酶测定为阴性，氧化酶测定为阳性。查伯杰氏手册为弧菌科弧菌属。3号菌：细胞球状，革兰氏反应阳性，菌片生生长，过氧化氢酶测定为阳性，氧化酶测定为阴性，代谢为发酵型。查伯杰氏手册为微球菌科葡萄球菌属。4号菌：细胞杆状，形成芽孢，不多于一个。革兰氏反应阳性，代谢为发酵代谢，产生过氧化氢酶。查伯杰氏手册为芽孢杆菌科芽孢杆菌属。实验心得：1、配方中使用的糖类不同，配置出的百里酚培养基的颜色不同。本实验使用了乳糖，培养基呈透明的墨绿色。通过与其他小组的交流，使用蔗糖配置出的兰色培养基观察效果较好。2、在细胞色素氧化酶测定实验中，用于培养实验材料的平板培养基由于在灭菌时，高压锅出现问题，灭菌不彻底，培养基中长出了众多杂菌菌落。由此更深一步加强了无菌操作及彻底灭菌的意识，灭菌不彻底或感染将会导致一次实验的失败。3、熟悉了一般微生物实验的整个操作过程以及一般实验都包括哪些部分。4、锻炼了独立思考，初步设计实验的能力。5、实验前应对整个实验进行充分的设计及统筹，包括实验当中要用到的器材的种类、数量、药品，并预先进行必要处理，如：灭菌等，以保证实验的正常进行。6、培养了团队协作精神。参考文献：《伯杰氏手册》