土壤耗氧微生物的分离与纯化操作步骤

土壤耗氧微生物的分离与纯化操作步骤关键词：标准物质标准物质网标准物质中心北京标准物质网1．稀释涂布平板法1)倒平板将肉膏朊胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号培养基、马丁氏培养基加热溶化，待冷却至55～60℃时，在高氏Ⅰ号培养基中加入10％酚数滴，在马丁氏培养基中加入链霉素溶液(终浓度为30Hg／mL)，混均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角烧瓶置火焰旁边，左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手撑边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞，也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住[图3—8(a)]。如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中[图3—8(c)]。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15mL[图3—8(c)]，加盖后轻轻摇动培养皿[图3—8(b)]，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。2)梯度法制备土壤稀释液称取土样10g，放人盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分7昆合，将细胞分散制成10-1浓度(图3—9A)。用一支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液加入盛有9mL无菌水的大试管中充分混匀[图3—8(b)]，然后用无菌吸管从此试管中吸取1mL[无菌操作见图3—8(c)]加入另一盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀。以此类推，分别制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。不同稀释度的土壤溶液，如图3—9所示。如果需要，还可以按此方法进一步梯度稀释。3)涂布将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5、10-6。三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5、10-6三管土壤稀释液中各吸取0．1～0．2mL对号放人已写好稀释度的平板中(图3—9B)，用无菌玻璃涂棒按图3—10在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。平板涂布方法：将0．1mL菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置(0．1mL的菌液要全部滴在培养基上；若吸移管尖端有剩余的，需将吸移管在培养基表面上轻轻地按一下便可)。右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。4)培养将高氏Ⅰ号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3～5d，牛肉膏朊胨平板倒置于37℃温室中培养2～3d。5)挑茵落将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上(图3—9c)，分别置28℃和37℃温室培养。待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。2．平板划线分离法1)倒平板按稀释涂布平板法倒好平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期。2)划线如图3一11所示，划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。常用的划线方法有下列两种：(1)用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次“之”字行划线3～4条[图3—11(a)]；再转动培养皿约70。角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线[图3一】1(b)]；再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线[图3—11(c)]；通过第三次平行划线部分作第四次平行划线[图3—11(d)]。继续第五次划线，并注意不要同前四区相连[图3—11(d)]。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。这种划线方法实际上是在一个平皿上起到连续稀释的作用，逐渐找到单菌落。(2)将挑取有样品的接种环在平板培养摹上作连续划线[图3—11(e)]，划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。3)挑菌落按稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。整个过程总结如图3—11所示。3．简易单孢子分离法1)厚壁磨口毛细滴管的制备截取一段玻璃管，在火焰烧红所要拉细的区域，然后用镊子夹住其尖端，在火焰上拉成很细的毛细管。从尖端适当的部位割断，用砂轮或砂纸仔细湿磨，使管口平整、光滑(毛细滴管要求达到点样时出液均匀、快速，每微升孢子悬液约点50微滴，每滴的尺寸略小于低倍镜的视野)。2)分离小室的准备取无菌培养皿(∅=9cm)倒入约10mL水琼脂(4％)作保湿剂。在皿盖上用记号笔(最好用红色)如图3一12所示画方格。待凝后倒置于37℃恒温箱烘数小时，使皿盖干燥。3)萌发孢子悬液的制备(1)孢子悬液的制备：用接种环挑取米曲霉孢子数环接入盛有10mL察氏培养基及玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振荡5～10min，使孢子充分散开。(2)过滤：用无菌漏斗(塞棉花)或自制的过滤装置将上述充分散开的孢子液过滤，收集过滤液。(3)孢子萌发：将孢子过滤液用血球计数板测定孢子的浓度，再用察氏培养基调整孢子液至(0．5～1.5)×106个孢子／mL，置28℃培养8h。(4)点样：用无菌自制的厚壁磨口毛细滴管吸取萌发孢子液少许，快速轻巧地点在培养皿的壁的方格内，每微滴面积略小于显微镜低倍镜视野。依次将每方格点上萌发孢子液，成为分离小室。最后将皿盖小心快速翻过来，盖在原来的平板上。(5)镜检：如图3一12所示，将点样的分离小室平板放在显微镜镜台上，用低倍镜逐个检查皿盖内壁上的微滴。如果观察到某微滴内只有一个萌发孢子，用记号笔在皿盖上做上记号。(6)加薄片培养基：取少量察氏培养基倒入无菌培养皿(培养皿先置45℃预热)中制成薄层平板，待其凝固后用无菌小刀片将平板琼脂切成若干小片(其面积应小于培养l皿盖上所画小方格的面积)，然后挑一小片放在有记号的单孢子微滴上，其他依次进行，最后盖好皿盖。(7)培养：将分离小室平板置28℃培养24h，直至单孢子形成微菌落。(8)转种：用无菌微型小刀小心地挑取长有微菌落的琼脂薄片，移至新鲜的察氏培养基斜面或液体培养中，置28℃培养4～7d，即可获得由单孢子发育而成的纯培养。