凝胶过滤层析

生物化学与分子生物学教研室实验八凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾及透析技术生物化学与分子生物学教研室掌握凝胶层析的原理通过血红蛋白脱盐实验，初步掌握凝胶层析技术了解凝胶层析的应用一、实验目的生物化学与分子生物学教研室凝胶过滤层析：是利用具有网状结构凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也称分子筛层析、排阻层析。二、实验原理生物化学与分子生物学教研室单个凝胶珠本身象“筛子”，不同类型凝胶的筛孔大小不同。交联葡聚糖的凝胶颗粒生物化学与分子生物学教研室分子筛效应：大分子在前，小分子在后生物化学与分子生物学教研室高铁血红蛋白分子量大(MetHb，红褐色，Mw=64500)，完全排阻Hb﹢K3Fe(CN)6MetHb高铁氰化钾分子量小(K3Fe(CN)6，黄色，Mw=327.25)，可完全进入凝胶颗粒网孔内，从而达到分离的目的生物化学与分子生物学教研室交联葡聚糖高铁血红蛋白与高铁氰化钾混合物高铁血红蛋白高铁氰化钾生物化学与分子生物学教研室利用特制的半透膜把大小分子分开的方法，截止分子量一般为一万。临床应用：血液透析透析液高铁血红蛋白色带透析袋开始透析处于平衡状态透析法：生物化学与分子生物学教研室钼酸铵+氨基萘酚磺酸+磷酸盐钼蓝（蓝色）15%三氯醋酸+蛋白质变性、沉淀生物化学与分子生物学教研室三、实验器材与试剂层析管、分液漏斗、吸管、透析袋、磁力搅拌器血红蛋白溶液交联葡聚糖G-250.4%K3Fe(CN)6氨基萘酚磺酸试剂钼酸铵试剂15%三氯醋酸0.1M磷酸缓冲液（pH7.0）生物化学与分子生物学教研室四、实验步骤1.凝胶的处理G-25颗粒(5g)蒸馏水室温溶胀去除杂质10倍体积的蒸馏水浸泡(过夜)生物化学与分子生物学教研室2.装柱固定在铁架上加入缓冲液没过砂芯将凝胶缓缓注入管内自然沉降至柱床高度达20cm左右不可露出床面盖滤纸层析管洗净、排出管中气泡关闭出口关闭出口打开出口生物化学与分子生物学教研室装柱要求:连续均匀无气泡无分层床面平整生物化学与分子生物学教研室层析柱稳定后接储液瓶，打开出口，用两倍于床体积的缓冲液洗脱平衡(5-10min)，不可露出床面，关闭出口3.平衡生物化学与分子生物学教研室4.加样准备血红蛋白(3滴)与K3Fe(CN)6(8滴)混合液自距床面2mm处靠壁缓慢、均匀加入至液面降至与凝胶面相平放掉多余缓冲液至刚露出床面打开出口生物化学与分子生物学教研室5.洗脱与收集至洗脱液刚好流入床面再加洗脱液至3-4cm高连接储液瓶调节活塞（1滴/5秒）进行洗脱缓慢加入样品量体积的洗脱液（不冲破胶面）打开出口关闭出口收集红褐色的MetHb色带生物化学与分子生物学教研室带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图生物化学与分子生物学教研室用洗耳球从层析柱下口慢慢将柱中的凝胶吹至小烧杯中回收，用玻棒挑出滤纸片将黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱后，用2~3倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶生物化学与分子生物学教研室将MetHb洗脱液装入透析袋将透析袋口用止水夹密封打开磁力搅拌器，透析30分钟将透析袋悬入装有蒸馏水的烧杯中6.透析生物化学与分子生物学教研室磷酸盐的鉴定试剂量钼酸铵试剂氨基萘酚磺酸试剂反应结果透析前杯内蒸馏水15滴2滴3滴？透析后杯内蒸馏水10滴2滴3滴？7.鉴定生物化学与分子生物学教研室蛋白质的鉴定试液量15%三氯醋酸反应结果透析前杯内蒸馏水40滴20滴？透析后杯内蒸馏水40滴20滴？透析袋内溶液10滴5滴？生物化学与分子生物学教研室装柱后检查凝胶是否均匀，若有气泡或分层时，加入缓冲液搅动后静置或者重新装柱，保持柱床面平整；洗脱时流速不可太快或太慢；透析袋中的液体不可装满，否则会将透析袋胀破。五、注意事项生物化学与分子生物学教研室磷酸盐的鉴定试剂量钼酸铵试剂氨基萘酚磺酸试剂反应结果透析前杯内蒸馏水15滴2滴3滴透析后杯内蒸馏水10滴2滴3滴无蓝色六、实验结果生物化学与分子生物学教研室蛋白质的鉴定试液量15%三氯醋酸反应结果透析前杯内蒸馏水40滴20滴透析后杯内蒸馏水40滴20滴透析袋内溶液10滴5滴无无有沉淀生物化学与分子生物学教研室MetHb的相对分子量较大，直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，流程较短，移动速度快，首先流出。生物化学与分子生物学教研室K3Fe(CN)6的相对分子质量较小，直径小于凝胶网孔可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中流程较长，移动速度慢，最后流出。生物化学与分子生物学教研室磷酸盐是小分子，小于透析袋孔径的小，能够穿过透析袋；而蛋白质是大分子，不能透过透析袋，只能保留在袋中。生物化学与分子生物学教研室向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶面平整？上样体积为什么不能太大？请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快或太慢？聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子筛效应和凝胶过滤的分子筛效应原理上有何不同？七、思考题生物化学与分子生物学教研室实验名称实验目的实验原理试剂和器材操作方法（主要步骤）结果分析思考题