基因工程实验流程

基因工程实验流程总览DNA提取，纯化限制图谱琼脂糖电泳检测片段体外扩增PCR目的基因制备载体选择DNA重组片段连接未知核酸序列须DNA片段大小估计互补性黏性不互补性黏性末端平末端限制性核酸内切酶酶切分离法简单基因组分离如质粒和病毒物理化学法构建基因组文库PCR扩增基因的化学合成双抗体免疫法酶促反应mRNA-cDNA目的基因分离双酶切部分酶切Bal31逐步切割转座子基因定位克隆酵母双杂交前处理防止自连RNA提取RT-PCRTA克隆蓝白选择胶回收表达引物PCR载体PCR产物回收转化感受态细胞构建基因组文库•真核生物有成千上万个碱基对，单个未知基因在整个基因组中的比例很小且不能在体外特异性扩增，所以只能对所有基因扩增，也就是构建基因组文库。油菜TOC33基因片的克隆实验项目背景国家自然科学基金项目（油菜叶绿体蛋白质转运突变体中差异表达基因的克隆，编号：30170500）。实验目的通过本综合实验，掌握植物基因组DNA的制备技术、PCR技术、限制性内切酶酶切技术、重组DNA技术、克隆鉴定技术、质粒DNA的制备、琼脂糖凝胶电泳技术、测序技术、生物信息技术等，得到一个与科学研究过程相近的分子生物学综合技能训练。具体实验步骤Ⅰ.植物基因组DNA的制备Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增Ⅲ.DNA的琼脂糖凝胶上回收与纯化IV.DNA片段的体外重组与转化V.克隆的筛选与鉴定VI.序列分析Ⅰ.植物基因组DNA的制备取0.2g样品嫩叶至1.5mLEP管中，放在液氮中冷冻处理后，在EP管中充分捣碎，加入0.6mL抽提缓冲液，65℃水浴处理10min。12,000rpm离心3min，取上清，加入二倍体积预冷的无水乙醇沉淀，遇有絮状沉淀，4,000rpm离心5min。沉淀用50ulTE-RNase（5.0mMTris.HClpH8.0，1.0mMEDTApH8.0，RNaseA30ug/mL）溶解，37℃保温处理15min。加入二倍体积预冷的无水乙醇，-20℃下沉淀10min，4,000rpm离心3min，加适量70%乙醇洗沉淀，自然干燥或37℃烘干，加入50ulddH2O溶解备用。Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增引物设计，为扩增Toc33片段，用OLIG05.0设计1对PCR引物:上游引物P1:5'一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3'，下游引物P2：5'一TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一3'。在0.2mLEppendorf管内配制25ul反应体系：10×PCRBuffer2.5ulMg2+1.5uldNTP1.0ulPrimer11.0ulPrimer21.0ulTaq酶0.5ul模板1.0ulddH2O16.5ul1)94oC预变性5min2)94oC变性30sec3)55oC退火30sec4)72oC延伸45sec5)重复步骤2)-4)30次6)72oC延伸10min琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果1)称取0.5g琼脂糖放入溶胶瓶中，再加入1ml50×TAE缓冲液，49ml高水，置微波炉或水浴加热至完全融化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。2)取电泳槽里面的胶板，用胶带将两端封好，调平，并放好样品梳子。3)将冷到60oC左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入胶板，直至胶板上形成一层均匀的胶面。4)待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。电泳槽内应加入电泳缓冲液。5)用移液枪将已加入上样缓冲液的PCR产物加入加样孔。6)接通电泳槽和电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）；选择合适的电压，开始电泳；7)当溴酚蓝燃料移动倒距离凝胶前言1－2cm处，停止电泳。8)将电泳的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色10min后取出，用清水冲洗。将胶放于凝胶成像系统内拍照，以观察样品在琼脂糖凝胶中的带（EB有剧毒，戴手套操作）。电泳染色后，在紫外分析仪上切取所需要的条带，按1克胶：1000添加提取缓冲液，放在60度的金属浴中溶解。然后把溶液转移到试剂盒专用管中，6000转/分离心1分钟；倒掉上清，再加入500微升的extractionbuffer,12000r/min离心1分钟；倒掉上清，加入750微升的washbuffer,12000r/min离心1分钟；倒掉上清，重复步骤三；倒掉上清，在12000r/min下空转1分钟；把带有膜的管子换到新的EP管中，加入30~50微升的水，静置1分钟，12000r/min离心一分钟，即得到所要回收的片断。此样品可用来做酶切等。Ⅲ.琼脂糖凝胶上DNA的回收与纯化IV.DNA片段的体外重组加试剂顺序由上到下（用500ul的EP管装），加完之后混匀，短时离心，用封口胶封口。将EP管放入金属浴当中37度酶切两个半小时左右，取出酶切产物，用试剂盒进行割胶回收进一步纯化酶切片断以进行连接反应。酶切体系：40.0ulddH2O9.0ul10×Buffer4.0ulDNA25.0ulXbaI、1.0ulHindIII1.0ul连接反应：连接体系：（20.0ul）酶切产物3.0ulBuffer1.0ul载体14.0ulLiagse2.0ul加试剂顺序由上到下（用500ul的EP管装），加完之后混匀，短时离心，用封口胶封口。将EP管放入金属浴当中16度连接过夜。IV.DNA片段的转化1.从液氮中取出感受态细胞，完全融化后，用移液枪将连接产物加入感受态细胞中，温柔混匀，在冰上放置半个小时。2.42OC热激90sec。再在冰上放10min，然后导入SOC（1.5mlEP管）中，在37OC摇床上200rpm进行振荡一小时。3.在这段时间里可以准备平板，25ml左右加了抗生素的60度左右的LB固体培养基倒入事先灭菌的培养皿中，在表面涂布上X-gal和ITPG;4.取出摇得菌液在离心机上6000转每分钟离心五分钟。然后将大部分培养基倒出，剩余大概五十微升左右的SOC即可。注意不可将沉淀倒出。5.用移液枪将沉淀吹散均匀，将其加入事先倒好的平板上，加入涂布玻璃珠进行涂布。涂布均匀后将平板倒置放于37OC培养箱内过夜培养。第二天从转化的平板上挑去白色的菌落以验证是否是阳性克隆V.克隆的筛选与鉴定1.用移液枪在1.5mlEP管中加入液体LB培养基500ul，再用灭过菌的牙签在生长蓝白斑的平板上挑取阳性克隆放于EP管中，丢弃牙签，盖紧管口，用报纸包好放到37OC，200r/min的摇床中过夜培养；2.EP管出现混浊，用质粒提取试剂盒提取质粒。3.对于得到的质粒再酶切电泳检测阳性克隆，如果酶切后的电泳图上出现了与插入片断相应大小的条带，证明是此单菌落是阳性克隆，否则是假阳性的。试剂盒质粒回收过程•把过夜培养菌液，10000r/min离心1分钟，倒掉上清液；•向菌体中加入质粒回收试剂盒中的SolutionI400微升，震荡，直到沉淀的菌体完全悬浮；•然后加入400微升的SolutionII，轻轻地颠倒混匀，然后在室温下放置2分钟；•加入525微升的SolutionIII，颠倒混匀，直到出现白色的絮状沉淀，10000r/min离心10分钟；•把上清液转移到试剂盒专用管中，10000r/min离心1分钟;•倒掉溶液，向管子中加入600微升的bufferHB，10000r/min离心1分钟；•倒掉溶液，加入750微升的washbuffer,10000r/min离心1分钟;•重复上一步骤7次；•倒掉溶液后空转一次，以尽量除尽残余的washbuffer;•将带有膜的管子转移到新的EP管中，加入100微升的水，静置1分钟，10000r/min离心1分钟，即得到所需要的质粒。VI.序列分析获得的阳性单克隆送样测序，测序结果的同源性比较采用GenBank中的BLAST分析程序，基因序列比较运用DNAsist软件。•实验起始材料的选取和准备•mRNA的提取、纯化•目标片段的克隆和分析•DNA、RNA的提取、纯化和分析•克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析•基因转化实验及转基因结果分析一、实验起始材料的选取和准备水稻卵细胞的分离分离准备工作材料的速冻长期保存人工气候箱、制冰机超净工作台、显微操作系统RNase-free耗材、液氮罐超低温冰箱RNase抑制剂二、卵细胞mRNA的提取、纯化Oligotex系列试剂盒细胞裂解匀浆去蛋白和细胞残渣温浴并结合洗脱去盐和回收旋涡混匀器离心机恒温水浴锅离心机、旋涡混匀器200℃烘箱DEPC、RNase-freeDNaseI、RNase-free耗材三、目标片段的克隆和分析•利用SMARTcDNA文库构建试剂盒构建水稻卵细胞cDNA文库；•目标基因的获得；•通过噬菌体载体自切割或T-Vector、平末端载体克隆获得目标质粒；•利用测序仪和通用引物对克隆的目的基因测序；1.通过SMART技术构建cDNA文库第一链的合成第二链的合成和扩增酶切、纯化和片段分离cDNA检测插入载体并包装文库质量检测文库扩增及保藏恒温水浴锅、制冰机RTase、RNase抑制剂PCR仪高保真Taq酶恒温水浴锅、离心机限制性内切酶、过滤柱电泳仪器、凝胶成像系统琼脂糖恒温水浴锅超净工作台、烘箱、PCR仪培养基超低温冰箱DMSO2.目标基因的克隆•利用特异探针，通过核酸杂交的方法或利用特异的抗体，通过抗原-抗体反应进行文库目标基因的筛选将培养于平板的噬菌斑通过印迹转于尼龙膜，并于核酸交联仪中固定。在杂交箱中利用特定探针杂交。最后在恒温摇床中洗膜（探针标记：放射性和非放射性）将噬菌体培养于平板，于42℃培养几小时后，于37℃用IPTG诱导融合蛋白的表达并印记于尼龙膜上，利用抗原-抗体反应进行杂交•利用GSP（基因特异引物）通过PCR扩增出目标基因利用GSP，以文库为模板通过PCR扩增出目标基因，并通过电泳、凝胶成像系统检测。利用文库载体序列和已知的目标基因的序列设计通用引物和GSP，通过5’RACE和3’RACE扩增出目标基因的5’和3’端序列。并通过电泳、凝胶成像系统检测。•通过5‘RACE和3’RACE克隆已知部分序列的目标基因四、DNA、RNA的提取、纯化和分析•包含有目标基因的质粒的获得对于通过筛库技术获得的目标基因，通过噬菌体载体的自切割作用生成目标质粒。•水稻基因组DNA的提取、纯化和分析•水稻各器官TotalRNA的提取、纯化和分析质粒提取、分析•常规质粒提取方法：通过细菌的适当裂解释放出质粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用无水乙醇沉淀质粒DNA•质粒提取试剂盒：裂解方法一致。裂解完成后利用过滤柱纯化出质粒DNA•质粒提取后，根据以后实验要求利用不同的限制性内切酶在水浴锅中进行酶切•电泳，用凝胶成像系统分析•测序水稻基因组DNA的提取、纯化和分析•利用SDS法或Qiagen提供的基因组提取试剂盒提取水稻基因组DNA：利用SDS在高钾离子浓度的情况下能沉淀蛋白和多糖等杂质的原理提取基因组DNA•利用酚-氯仿抽提或过滤柱纯化基因组DNA•水稻基因组文库的构建•利用特异的探针，通过Southernblotting检测目标基因的拷贝数水稻各器官TotalRNA的提取、纯化和分析•分离所需的水稻各器官组织，并利用Qiagen的RNeasy系列试剂盒提取总RNA：将材料裂解后，通过过滤柱纯化出总RNA•在RNase-free的情况下，通过甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量•利用特异性的探针，通过Northernblotting检测目标基因在各器官的表达情况Southernblotting基因组DNA完全消化探针制备琼脂水平电泳比活性测定印迹转膜DNA交联限制性内切酶、恒温水浴锅手提紫外灯、电泳仪器真空转膜仪紫外交联仪同位素检测仪探针制备试剂盒尼龙膜制备好的尼龙膜探针（放射性或非放射性）杂交杂交箱放射自显影荧光同位素检测仪磷屏成像系统荧光扫描成像系统克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析•克隆化基因的表达•表达蛋白的纯化•功能分析克隆化基因的表达•基因的克隆：利用高保真的Taq酶和合适的反应系统，通过PCR获得与目标基因完全一致的DNA片段（通过测序确证）•体内表达：选择合适