单克隆抗体的制备

中学生物学习中的筛选问题例析已发表“筛选”是生物学中培育生物新类型常用的手段，在高中生物学习中常常遇到有关筛选的问题，现在进行归纳例析。1单克隆抗体制备中的筛选问题在单克隆抗体制备过程中，有两次的筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞(用选择性培养基);第2次是进一步选出能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞.。利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理是根据以下三个原则：①淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体；②细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；③利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的单克隆抗体例1已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中虽有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获是杂种细胞（1)试管中除融合的杂种细胞外，还有____种融合细胞（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说明原理方法：原理：解析：（1）在细胞融合过程中两个细胞之间是随机进行的，两个骨髓瘤细胞之间或两个淋巴细胞之间或两个不同的细胞之间是随机进行的，因此有三种融合方式。（2）试管中细胞共有5种(只考虑两个细胞的融合)：效应B淋巴细胞及其自身融合的细胞、鼠骨髓瘤细胞及其自身融合的细胞、杂交瘤细胞。因为效应B淋巴细胞中DNA的复制有D途径和S途径，但本身不会连续增殖，故培养一段时间后效应B淋巴细胞及其自身融合的细胞全部死亡；鼠骨髓瘤细胞内DNA的复制只有D途径，而D途径可以被氨基嘌呤阻断，故加入氨基嘌呤后培养一段时间，鼠骨髓瘤细胞及其自身融合的细胞也会死亡；只有效应B淋巴细胞和鼠骨髓瘤细胞结合后产生的杂交瘤细胞既可以无限繁殖，又具有S途径，所以可以连续繁殖而被筛选出来。答案：（1）2；（2）培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞；加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞中可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。2基因工程中的筛选问题在基因工程中，利用运载体上的标记基因可以筛选出导入了目的基因的受体细胞。标记基因常有抗抗生素基因或荧光蛋白基因等。例2研究人员想将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内，以表达产生生长激素。已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，且目的基因不插入到基因A、B中，而大肠杆菌不带有任何抗性基因。则筛选获得“工程菌”的培养基中的抗生素首先应该A．仅有链霉素B．仅有抗氨苄青霉素C．同时含链霉素和抗氨苄青霉素D．无链霉素和抗氨苄青霉素解析：在基因工程中，目的基因是否导入受体细胞中，主要根据载体质粒上的标记基因确定的。根据题意，目的基因没有插入到基因A、B中，说明这两个标记基因没有被破坏，抗链霉素基因和抗氨苄青霉素基因都能表达，所以应该用同时含有链霉素和抗氨苄青霉素的选择培养基进行筛选。．答案为C3营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型突变株的筛选有多种方法。不同的微生物菌株选用的方法不同，①抗生素法某些抗生素能杀死正生长繁殖着的微生物，而对处于休止状态的微生物无杀伤作用。用加有青霉素的培养基来选择细菌的营养缺陷型就是由于青霉素是细菌细胞壁的合成抑制剂，利用其可杀死正在繁殖的细菌的性质，②菌丝过滤法适用于放线菌、霉菌等丝状微生物。在基本培养基中野生型孢子能萌发长成菌丝体，而营养缺陷型孢子则不生长。将经诱变处理的孢子接种于液态基本培养基中，振荡培养lOh—12h，使原养型萌发(以肉眼刚能看见菌丝为度)，然后以滤纸、棉花或玻璃过滤漏斗过滤，菌丝被滤除，未萌发的缺陷型孢子能顺利通过，从而达到富集营养缺陷型的目的。③逐个测定法(点种法)把经诱变处理并淘汰野生型后的菌液在完全培养基上涂布分离，将培养后长出的每一个菌落分别点种在基本培养基和另一个完全培养基上，凡在基本培养基上不能生长而在完全培养基的相应位置上能生长的菌落，表明其为营养缺陷型。④夹层培养法经诱变处理后的菌液，稀释后与基本培养基混匀并倾入平皿中，待凝固后，再加上一薄层不含菌的基本培养基。培养后在皿底将长出的菌落做上标记。然后加上一层完全培养基，再经培养后，新出现的菌落多数是营养缺陷型。此法适用于兼性厌氧的细菌。⑤影印法将丝绒包在直径小于平皿的圆柱台上固定，作为影印接种工具，灭菌后备用。将经诱变处理并淘汰野生型的菌液涂布于完全培养基表面上，培养待长出菌落后，用影印接种工具在此平板上轻按一下，然后在另一基本培养基平板上按一下。经培养后在基本培养基上不长而在完全培养基的相应部位上生长的菌落，为营养缺陷型。例3酵母菌通过通过基因突变能产生营养缺陷型菌株，由于营养缺陷型菌株丧失了合成氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等的能力，不能在基本培养基中生长，必须在基本培养基中补充某些物质才能生长。下图简要表明了科学研究者用紫外线处理野生型啤酒酵母菌单倍体获得其营养缺陷型菌株的方法。根据以上叙述，回答下列问题：（1）啤酒酵母菌产生能量的场所是，其结构不同于细菌的主要特点是。（2）紫外线处理野生型啤酒酵母菌诱发产生营养缺陷型菌株时，选用单倍体酵母菌的好处是。（3）BrdU是一种嘧啶类似物，酵母菌在繁殖过程中摄取BrdU并替代胸腺嘧啶脱氧核苷酸的位置掺入到新合成的DNA链中。含BrdU的DNA的酵母菌因其比正常的DNA更容易被紫外线破坏而死亡，不繁殖的酵母菌由于不能利用BrdU，其DNA对紫外线不敏感而存活下来。如果上图2中的营养缺陷型是甘氨酸营养缺陷突变型，利用上述原理如何将突变型菌株从野生型菌株中筛选出来并大量繁殖？请简要叙述实验方案。①②③解析：酵母菌作为真核细胞，在线粒体和细胞质基质产生能量，基因成单存在时不论显隐性都可显现出来。甘氨酸营养缺陷突变型不能在基本培养基中，只有在添加甘氨酸才能生长。如果利用基本培养在进行培养，未突变的野生型能正常繁殖，所以在DNA复制时利用BrdU，这样用紫外线照射，由于野生型含有BrdU对紫外线敏感被杀死，而突变型由于在基本培养基中不能生长不被杀死。然后在存活下来的酵母菌中加入甘氨酸就可以获得大量的甘氨酸突变菌株。参考答案（1）线粒体和细胞质基质有成形的细胞核（2）其突变性状（包括隐性性状）容易表现出来（3）①配制缺少甘氨酸的基本培养基，在该基本培养基中再加入BrdU后，将图2中的酵母菌接种在上述培养基中，在适宜的条件下培养一段时间；②用紫外线照射处理；③将存活下来的酵母菌培养在加入甘氨酸的基本培养基中，就能获得大量的甘氨酸突变菌株。4育种中的筛选问题在杂交育种为选育出符合要求的显性纯合子时，让不同个体间杂交产生后代，然后连续自交，筛选所需纯合子。而筛选抗病虫害时常用相应的病原体感染的方法去进行筛选。此外在诱变育种、单倍体育种及利用基因工程育种过程中都要进行筛选。例4水稻种子中70％的磷以植酸形式存在，植酸同铁、钙等金属离子或蛋白质结合排出体外，是多种动物的抗营养因子，同时，排出的大量磷进入水体易引起水华，（1）为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。据图回答：①图中基因组文库____________（小于/等于/大于）cDNA文库。②B过程需要的酶是______________；A、C过程中_____________（可以/不可以）使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。③目的基因Ⅰ和Ⅱ除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中___________和_____________为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是_________________________。（2）已获得的转植酸酶基因水稻品系植酸含量低，但易感病，下图为选育低植酸抗病水稻品种的过程。图中两对相对性形状分别由两对基因控制，并独立遗传。采用上图育种过程，需从_______________代开始筛选，经筛选淘汰后，在选留的植株中低植酸抗病纯合体所占的比例是______________。选留植株多代自交，经筛选可获得低植酸抗病性状稳定的品性。解析：分析获取植酸酶基因的流程图可知，图中基因组文库大于cDNA文库。B过程需要的酶应该是逆转录酶，因为A、C过程都能获得含目的基因的菌株，所以可以使用同一种探针进行筛选。目的基因Ⅰ和Ⅱ除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中DNA和cDNA为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是耐高温。根据上图育种过程，所需性状在F2代中才开始出现，所以应从F2代开始筛选。从图中可以看出，低植酸抗病是双显性（在F2中占9/16），经筛选淘汰后，在选留的植株中纯合体所占的比例是1/9。答案（1）①大于②逆转录酶可以③DNAcDNA耐高温（2）F21/95有关微生物的筛选对于微生物来说，根据不同微生物的不同特点，从物理性质来说，常用固体培养基通过平板画线进行分离筛选。而从功能来说，可用选择培养基进行筛选。如用高NaCl培养基来筛选金黄色葡萄球菌。利用青霉素抑制原核细胞壁的形成可筛选出真核生物。从无氮培养基中可筛选出自生固氮菌，从无碳培养基中可筛选出自养型微生物。例5微生物与人类关系密切。虽然有些微生物能使动植物患病，但多数微生物对人类是有益的。请回答：（1）某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌（目的菌）。如图，①培养基中加入化合物A的目的是筛选______________，“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的_______________，实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是__________。②培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量_________的培养液，接入新的培养液中连续培养，使“目的菌”的数量______________。③转为固体培养时，常采用_____________的方法接种，获得单菌落后继续筛选。(2)培养微生物的培养基配方中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。从土壤中分离分解尿素的细菌时，培养基中加的唯一氮源为，而从土壤中筛选圆褐固氮菌时（需要/不需要）往培养基中加有机碳源，原因是。利用筛选圆褐固氮菌的培养基（能/不能）筛选出根瘤菌。解析：（1）由于研究人员为筛选到能高效降解化合物A的细菌（目的菌）。因此在培养基中加入化合物A作为唯一碳源和氮源是为了筛选出能分解化合物A的目的菌，即只要能生长的细菌就含有目的菌了，因此目的菌的氮源和碳源是来自培养基中的化合物A，它应该是异养型生物。培养一段时间，培养瓶中化合物A最少的培养液应该是目的菌含量较多，然后接入到新的培养液中使目的菌数量增多，而在固体培养基上接种时常用平板下划线的方法。(2)从土壤中分离分解尿素的细菌时，培养基中应使尿素作为唯一氮源，而圆褐固氮菌时是异养型生物，因此在培养基应加有机碳源，而根瘤菌在与相应的豆科植物形成共生关系时才能大量增殖。因此利用筛选圆褐固氮菌的培养基不能筛选出根瘤菌。答案（1）①目的菌化合物A异养需氧型②减少增加③划线(2)尿素需要圆褐固氮菌是异养型生物，只能利用有机碳源不能6变式提高1微生物需要的营养物质包括碳源、氮源、生长因子、水和无机盐，据此可以在培养基中控制某种化学物质的有无，来分离筛选微生物。如加入过量的氯化钠可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长；青霉素等抗生素能抑制细菌细胞壁的合成。下表是用于分离筛选硝化细菌、金黄色葡萄球菌、酵母的培养基的部分成分。下列有关叙述正确的是（D）编号成分含量编号成分含量①粉状硫10g⑤FeSO40.5g②（NH4）2SO40.4g⑥CaCl20.5g③K2HPO44g⑦H2O100mL④MgSO49.25gA．配制培养基时，在各种成分都溶化后分装前，要进行的操作是灭菌B．在上述培养基中加入适量的有机碳源，可筛选培养出硝化细菌C．如果在该培养基中加入过量的氯化钠，