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文件编号页次1/3文件名称初始污染菌方法验证版本/修改生效日期编制/日期审核/日期批准/日期1.目的验证产品初始污染菌数的试验方法。2.范围适用于质量部门对产品初始污染菌数验证试验的检测。3.职责质量检验人员负责执行此规程。4.依据标准及相关文件2010版《中华人民共和国药典第二部》附录ⅪJ微生物限度检查法GB/T19973.1-2005《医疗器械的灭菌-微生物学方法-第一部分产品中微生物数量的估计》GB15980-2009《一次性使用医疗用品卫生标准》5.试验产品6.注意事项6.1本操作应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的无菌操作台内进行。操作过程应尽量避免任何可能使结果发生偏差的污染。6.2无菌操作台必需定期进行洁净度检测�试验前提前开紫外灯15min后方可进行实验操作。6.3过滤器、滤膜、镊子以及无菌设备杯使用前应进行灭菌�使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性。7.器材与试剂7.1器材35℃恒温培养箱、23℃恒温培养箱、灭菌器、洁净工作台、无菌过滤装置、镊子、剪子、电子天平、移液器、接种环7.2稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液配制后按说明书要求进行灭菌。pH7.0无菌氯化钠溶液—蛋白胨缓冲液0.9%无菌氯化钠溶液。7.3培养基营养琼脂培养基：按说明书方法保存配制。玫瑰红钠琼脂培养基：按说明书方法保存配制。改良马丁液体培养基：按说明书方法保存配制。改良马丁琼脂培养基：按说明书方法保存配制。营养肉汤培养基：按说明书方法保存配制。8.计数方法的验证试验当建立产品初始污染菌数检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：以确认所采用的方法适合于该产品细菌、霉菌及酵母菌的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进文件编号页次2/3文件名称初始污染菌方法验证版本/修改生效日期编制/日期审核/日期批准/日期行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。8.1菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为0代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus〔CMCC�B�26003〕大肠埃希菌Escherichiacoli〔CMCC�B�11102〕枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis〔CMCC�B�63501〕白色念珠菌Candidaalbicans〔CMCC�F�98001〕黑曲霉Aspergillusniger〔CMCC�F�98003〕8.2菌液制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，30-35℃培养18-24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上23-28℃培养24-48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50-100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上23-28℃培养5-7天，加入3-5ml含0.05%（mol/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,,将孢子洗脱。然后采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内�用含0.05%（mol/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50-100cfu的孢子悬液。注：菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2-8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃�在验证过的贮存期内使用。8.3供试液的制备在洁净工作台内，将样品分别放入配制好的pH7.0无菌氯化钠溶液—蛋白胨缓冲液中，充分震荡，作为试验液。8.4培养条件细菌30-35℃培养3天；霉菌及酵母菌23-28℃培养5天；8.5验证方法8.5.1验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率★试验组菌回收率=（A-C）/B★稀释剂对照组菌回收率=D/B8.5.2薄膜过滤法依据ISO11737-1所述，膜过滤法尤其适用于微生物浓度较低的悬液。因此本验证首选薄膜过滤法。A.试验组①100ml样品供试液②100ml稀释的菌悬液，包括：1ml含50-100cfu的菌悬液和99mlPH7.0文件编号页次3/3文件名称初始污染菌方法验证版本/修改生效日期编制/日期审核/日期批准/日期无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液；B.菌液组①100ml稀释的菌悬液，包括:1ml含50-100cfu的菌悬液和99mlPH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液;C.供试品对照组①100ml样品供试液②冲洗液:100ml无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液PH7.0D.稀释剂对照组①100ml无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液PH7.0②100ml稀释的菌悬液,包括:1ml含50-100cfu的菌悬液和99mlPH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液;8.5.3结果判定在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌数回收率应均不低于70%。若试验组的菌数回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数�若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%，应采用其它适宜方法，并重新进行验证。8.5.4结果见附表19.清场检验完毕�将使用的试剂归位�清理台面�并将用过的工具进行清洗。检测人员应及时填写《产品初始污染菌数验证测定试验记录表》�并对检验结果进行判定。10.判定标准标准在GB15980-2009《一次性使用医疗用品卫生标准》中找11.附表1：《产品初始污染菌数验证测定试验记录表》；注：培养基适用性应有另外验证报告；