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中国组织工程研究第20卷第20期2016–05–13出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchMay13,2016Vol.20,No.20P.O.Box10002,Shenyang110180·研究原著·吕卫东，男，1976年生，河南省灵宝市人，博士，副主任医师，主要从事生物材料组织工程学在肿瘤中的应用研究。中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)20-02972-07稿件接受：2016-03-17，蔡琳2，张家东1，3，雷光焰1，刘志刚1，张新伟1，陆建荣2(陕西省肿瘤医院，1胸外科，2病理科，陕西省西安市710061；3陕西中医学院附属医院，陕西省咸阳市712046)引用本文：吕卫东，蔡琳，张家东，雷光焰，刘志刚，张新伟，陆建荣.制备小鼠去细胞拟胚体对Lewis肺癌细胞的促分化作用[J].中国组织工程研究，2016，20(20):2972-2978.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.20.012ORCID:0000-0003-2685-4218(吕卫东)文章快速阅读：文题释义：去细胞拟胚体：胚胎干细胞可在一定条件下分化成具有内、中、外3胚层结构的拟胚体，而拟胚体用去细胞技术处理后得到的脱细胞三维细胞外基质材料即为去细胞拟胚体，其可能因为保留拟胚体的细胞外基质成分、三维空间结构和生物机械性能而有拟胚体的一些功能。三维培养：传统研究肿瘤发生的方法包括体外肿瘤细胞二维培养和建立体内鼠肿瘤模型，但是二者均有局限性：肿瘤细胞二维培养不能很好的反映体内肿瘤的微环境，而体内实验在控制单独细胞信号方面功能不足。体外三维培养能够克服以上不足。三维培养下肿瘤细胞的形态和表型类似于体内肿瘤，能够动态观察肿瘤细胞变化，已经被用于设定培养条件下肿瘤的发生、生长和转移的相关研究。摘要背景：胚胎干细胞或胚胎组织与癌细胞共培养，能够诱导癌细胞分化为正常上皮细胞或恶性程度降低，而去细胞拟胚体保留了胚胎组织的结构和重要细胞因子。目的：成功制备一种来源于小鼠胚胎干细胞的去细胞拟胚体，探讨去细胞拟胚体在小鼠Lewis肺癌细胞体外三维培养中的作用。方法：先将小鼠胚胎干细胞(D3)动态培养7d后形成拟胚体，然后用十二烷基硫酸钠进行去细胞处理。小鼠Lewis肺癌细胞与去细胞拟胚体三维共培养7d，对照组肺癌细胞在Matrigel上三维培养7d。Ki67免疫组化染色检测细胞增殖情况，Westernblot检测Paxillin，E-cadherin蛋白表达水平，RT-PCR检测Slug和E-cadherinmRNA表达水平。结果与结论：①实验成功制备一种大小均匀的小鼠拟胚体，经十二烷基硫酸钠去细胞处理后，拟胚体的细胞成分完全去除；②小鼠Lewis肺癌细胞在Matrigel上三维培养7d后形成球形的肿瘤多细胞球体，Ki67免疫组化染色阳性细胞比例高；小鼠Lewis肺癌细胞在去细胞拟胚体支架上三维培养7d，可见肺癌细胞长入拟胚体，但Ki67阳性细胞比例明显降低；③相对于Matrigel组，去细胞拟胚体组的Paxillin吸光度小于Matrigel组(P0.05)，而E-cadherin吸光度大于Matrigel组(P0.05)；④去细胞拟胚体组的SlugmRNA表达明显低于Matrigel组(P0.05)，而E-cadherinmRNA表达高于Matrigel组(P0.05)；⑤结果表明，去细胞拟胚体对小鼠Lewis肺癌细胞在体外三维培养有促进分化作用。关键词：组织构建；组织工程；胚胎；去细胞；拟胚体；Lewis肺癌细胞；细胞外基质；生物材料；三维支架；三维培养；国家自然科学基金制备小鼠去细胞拟胚体影响小鼠Lewis肺癌细胞恶性行为的过程小鼠胚胎干细胞培养与扩增拟胚体形成去细胞拟胚体小鼠Lewis肺癌细胞扩增体外三维培养小鼠Lewis肺癌细胞恶性行为评价去细胞拟胚体对小鼠Lewis肺癌细胞在体外三维培养有促进分化作用吕卫东，等.制备小鼠去细胞拟胚体对Lewis肺癌细胞的促分化作用ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH2973’an710061,ShaanxiProvince,China主题词：胚状体；细胞外基质；癌,Lewis肺；细胞系,肿瘤；组织工程基金资助：国家自然科学基金资助项目(31100686)；陕西省自然科学基金面上项目(2015JM8435)Acellularembryoidbodiesinmice:preparationandeffectofpromotingdifferentiationofLewislungcarcinomacellsLvWei-dong1,CaiLin2,ZhangJia-dong1,3,LeiGuang-yan1,LiuZhi-gang1,ZhangXin-wei1,LuJian-rong2(1DepartmentofThoracicSurgery,2DepartmentofPathology,TumorHospitalofShaanxi,Xi’an710061,ShaanxiProvince,China;3AffiliatedHospitalofShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712046,ShaanxiProvince,China)AbstractBACKGROUND:Co-culturewithembryonicstemcellsorembryonictissuescaninducedifferentiationofcarcinomacellsintonormalepithelialcellsordecreasemalignancyofcarcinomacells.Acellularembryoidbodiesretainthestructureandimportantcytokinesofembryonictissues.OBJECTIVE:ToprepareacellularembryoidbodiesfrommouseembryonicstemcellsandtoinvestigatetheireffectsondifferentiationofmouseLewislungcarcinomacellsatthree-dimensionalcultureinvitro.METHODS:Mouseembryonicstemcells(D3)weredynamicallyculturedfor7daystoproduceembryoidbodiesfollowedbydecellularizationwith0.1%sodiumdodecylsulfate.MouseLewislungcarcinomacellswereco-culturedwithacellularembryoidbodiesastestgrouporculturedinthree-dimensionalmatrigelmediumfor7daysascontrolgroup,respectively.CellproliferationandexpressionofE-cadherinweredetectedbyimmunohistochemicalstainingandwesternblotassay,respectively.Inaddition,mRNAexpressionsofSlugandE-cadherinwereobservedusingRT-PCRtechnology.RESULTSANDCONCLUSION:Uniformmouseembryoidbodiesweresuccessfullyprepared,andwerecompletelydecellularizedwithsodiumdodecylsulfate.After7-daythree-dimensionalmatrigelculture,inthecontrolgroup,multicellulartumorspheroidswereformed,accompaniedbyahigherKi67positiverate;LewislungcarcinomacellsinthetestgroupwererepopulatedintheacellularembryoidbodiesshowingsignificantlylowerKi67positiverate.Comparedwiththecontrolgroup,theabsorbanceofPaxillininthetestgroupwassignificantlysmaller,andtheabsorbanceofE-cadherinwassignificantlyhigher(P0.05).Besides,mRNAexpressionsofSlugandE-cadherinweresignificantlydecreasedandincreasedinthetestgroupcomparedwiththecontrolgroup,respectively(P0.05).ThesefindingsindicatethattheacellularembryoidbodiescanpromotedifferentiationofmouseLewislungcarcinomacellsinthree-dimensionalcultureinvitro.Subjectheadings:EmbryoidBodies;ExtracellularMatrix;Carcinoma,LewisLung;CellLine,Tumor;TissueEngineeringFunding:theNationalNaturalScienceFoundationofChina,No.31100686;theNaturalScienceFoundationofShaanxi,No.2015JM8435Citethisarticle:LvWD,CaiL,ZhangJD,LeiGY,LiuZG,ZhangXW,LuJR.Acellularembryoidbodiesinmice:preparationandeffectofpromotingdifferentiationofLewislungcarcinomacells.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(20):2972-2978.0引言Introduction胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，胚胎干细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。癌细胞与胚胎干细胞有许多共性，如胚胎干细胞与癌细胞都快速分裂、具有迁移性、可发生上皮-间质转化[1]。胚胎干细胞与癌细胞有不同的转归，胚胎干细胞分化为成体干细胞与祖细胞并最终分化成正常结构，而癌细胞则无限制地增殖，其中细胞外基质结构的变化在癌症的形成过程中发挥核心作用。如正常乳腺上皮细胞可以通过诱导形成增生并进一步转变成癌组织[2]。在不同的细胞微环境下，同一种细胞有不同的转归。胚胎干细胞或胚胎组织与癌细胞共培养，能够诱导癌细胞分化成正常上皮细胞或恶性程度降低[3-4]。胚胎干细胞在添加白血病抑制因子的培养基中诱导增殖，并可维持其未分化状