搜索
溶菌酶结晶的制备及活力测定研究制药工程2011级制药11班×××指导老师××摘要目的：探讨溶菌酶结晶的制备及活力测定的方法。方法：以蛋清为原料制备溶菌酶结晶，首先将鸡蛋中的蛋清与蛋黄分离，取蛋清，然后用处理好的“724”树脂吸附，接着用蒸馏水洗涤，再经树脂洗脱，将所需物质与鸡蛋清中的其他蛋白质分离，然后再经盐析、纯化处理所得到的溶菌酶即可得结晶。将所得酶和底物分别放入25OC恒温水浴预热10分钟，吸取底物悬浮液4mL放入比色杯中，在450nm波长读出吸光度，此为零时读数。然后吸取样品液0.2mL（相当于10µg酶），每隔30s读1次吸光度，共计下四个读数。结果：无结晶生成。结论：溶菌酶结晶的制备及活力测定研究实验以失败告终。关键词：溶菌酶结晶活力测定ThePreparationOfLysozymeCrystallizationAndActivityAssayPharmaceuticalEngineering2011ZhenlinWeiSupervisorWeiminAbstractGold:tostudythelysozymecrystallizationmethodofpreparationandactivityassay.Methods:witheggwhitelysozymecrystallizationasrawmaterialpreparation,firstofall,separatetheeggsintheeggwhiteandyolk,eggwhite,a724andthenuseprocessingresinadsorption,thenwashingwithdistilledwater,thenthroughresinelution,therequiredmaterialandotherproteinseparationofeggqingdynasty,andthenreceivedbysaltingout,purificationprocessingoflysozymecrystallization.Puttheenzymeandsubstraterespectivelyin25OCpreheatconstanttemperaturewaterbathfor10minutes,drainthesubstratesuspension4mlintocolorimetriccup,readtheabsorbanceat450nmwavelength,thisiszeroreadings.Thenabsorbstheliquidsample0.2mL(equivalentto10(includinggenzyme),every30sread1absorbance,atotaloffourreadings.Results:nocrystallizationgenerated.Conclusion:thepreparationoflysozymecrystallizationanddynamicmeasurementexperimentendedinfailure.Keywords:lysozymecrystallizationactivityassay前言溶菌酶(Lysozyme,EC3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶（Muramidase），是由英国细菌学家弗莱明(Fleming)在192年在人的眼泪、唾液中发现的[1]。溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液（如淋液）中及白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含有此酶[2]。其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的[3]。李鹤等在食品研究与开发中提到了溶菌酶已确定的三种作用：1)将溶菌酶固定化在食品包装材料上,生产出有抗菌功效的食品包装材料,以达到抗菌保鲜功能。2)将溶菌酶固定化在HEPA(空气过滤器)上,作为空调的空气净化系统,使其具有高效除尘和杀菌两大功能。当空气通过滤网时,先滤集捕捉尘粒和细菌,然后将捕捉到的细菌杀灭[4]。3)用溶菌酶非专一性地降解海洋生物高分子壳聚糖,使其成为能被人体吸收的低分子量具有独特生理活性和功能性质的低聚壳聚糖[5]。近几年,溶菌酶被广泛运用于医药、食品行业。溶菌酶作为一种天然蛋白质,能在胃肠内作用于营养物质被消化和吸收,对人体无毒性,也不会在体内残留,是一种安全性很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品[8]。溶菌酶可用于各种加工食品或饮料制作中,集药理、保健和防腐三种功能于一体[10]。因此,在倡导绿色食品的今天,溶菌酶的应用前景是相当广阔的应用前景[6]。1、材料与方法1．1实验试剂鸡蛋清，10%硫酸铵，固体硫酸铵，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，十二水磷酸二氢钠，十二水磷酸氢二钠，EDTA，底物干菌粉，“724”树脂，丙酮。1．2仪器721型分光光度计，抽滤瓶及布氏漏斗，研钵，恒温水浴，离心机，透析袋，1cmx35cm层析柱，吸量管：0.1ml、0.2ml、1ml、5ml，真空干燥器。1．3实验方法及步骤蛋清的制备将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约80~100ml，计量体积，用冰块预冷至0摄氏度备用[7]。树脂吸附将处理好的“724”树脂用布氏漏斗抽干，取湿树脂20g（约为蛋清量的1/5~1/4），在不断搅拌下加入预冷的蛋清中，再继续搅拌3h使充分吸附，静置过夜（0~5摄氏度）[9]。洗涤将树脂移入烧杯，取10%硫酸铵溶液30~40ml（树脂量2倍，不可多用！）分3次加入搅拌（15min）洗脱，抽干树脂，合并洗脱液（滤液），树脂保存供再生。脱盐沉淀用1ml蒸馏水溶解后转入透析袋，用蒸馏水透析24h（0~5摄氏度冰箱），中途换水3~5次，或流水（搅拌）透析24h。去除碱性杂蛋白将上述透析液用1mol/LNaOH（最后用0.1mol/LNaOH）溶液调至pH8.0~8.5。如有沉淀，离心除去[14]。结晶用药勺在搅拌下慢慢向酶液中加入5%（W/V）研细的固体NaCl，注意防止局部过浓。加完后用NaOH溶液慢慢调至pH9.5~10.0，室温下静置48h。结晶观察与收取肉眼观察有结晶形成后，用滴管吸取结晶液1滴置于载玻片上，在低倍显微镜下观察并画出结晶图形。离心或过滤收集酶晶体，用少量丙酮洗涤晶体2次，以五氧化二磷真空干燥后称重。酶活力的测定底物的制备将微球菌接种于液体培养基扩大培养(28℃,24h),再接种于固体培养基培养(28℃,48h),用无菌水将菌体洗涤,4000rpm离心10min,弃上清,再洗菌体数次,最后用少量无菌水制成悬液,冷冻干燥即得干菌粉[11]。取干菌粉5g,加入少量0.1mol/L的pH6.2磷酸缓冲液置于匀浆器或研钵中研磨2min,倾出并稀释至20～25mL,悬液的光密度OD450在0.5～0.7范围为宜。酶液的制备准确称取干溶菌酶粉5mg,用0.1mol/L的pH6.2磷酸缓冲液溶解成0.05mol/L酶液。酶活力测定将酶液与底物悬液分别置于25℃水浴中保温10～15min,测底物悬液的OD450值,作为对照。然后加入酶液0.2mL(约10μg酶蛋白)迅速摇匀。从加酶时开始记时,每30s测1次OD450值,共测3次[17]。酶活力的计算以每毫克溶菌酶每分钟使吸光度降低0.001个单位为1个酶活力单位。溶菌酶活力=ΔOD450/(0.001×W)(U/mg)式中,ΔOD450为450nm处每分钟吸光度的变化；W为加入的酶量(mg)。1．4数据处理（1）计算：活力单位定义是：在25摄氏度，pH6.2，波长为450nm时，每分钟引起吸光度下降0.001为一个活力单位。每1mg酶活力单位数=吸光度×1000/样品（ug）（2）计算溶菌酶的收率并由其效价计算总活力回收率。收率=干燥的酶重量/蛋清总重量×100%总活力回收率=（酶重量×效价）/蛋清总重量2、结果在溶菌酶结晶制备时无结晶形成，无法进行酶活力测定实验。3、结论及分析3.1可能与实验过程中溶液的pH值有关，酶活性在pH6.0~6.5最强,且在pH5~7范围内较稳定[15]。实验结果无结晶生成，其原因可能是在实验过程中溶液的pH过酸或过碱，导致酶失活了，故无结晶生成。3.2可能与实验过程中溶液的温度有关，酶活性在25~65摄氏度范围内随着作用温度的升高酶的活性增强,但温度太高则变性失活[16]。实验结果无结晶生成，其原因可能是在实验过程的溶液的温度过高，导致酶失活，故无结晶生成。3.3可能与实验所用的蛋清的量有关，因为是小实验，所以实验所用蛋清的量约80~100ml，本来蛋清中就含有多种蛋白质，溶菌酶的含量也不高，并且在实验的过程中还会造成一定程度的损失，导致达不到结晶时对溶菌酶的浓度要求，故无结晶生成。参考文献[1]宗柱，楚慧民，溶菌酶的应用前景和提取工艺，[J]，农牧产品开发，1996，(4)，30-31.[2]楼善贤，溶菌酶的研究进展，[J]，浙江肿瘤通讯，1991，（4），48-52.[3]刘文会，从鸡蛋清中提取溶菌酶的研究，[N]，北京化工大学硕士研究生学位论文，2003，（4），1-60.[4]刘贤明,马云骏.含溶菌酶的HEPA与双重杀菌过滤技术[J].节能环保,2001(2):20-21.[5]周桂,黄在银,谭学才,等.溶菌酶对海洋生物高分子壳聚糖的降解研究[J].海洋科学,2002(3):53-56.[6]李鹤,马力*,王维香溶菌酶的研究现状[J]食品研究与开发，2008,29（1）：182-185.[7]赵龙飞,徐亚军.鸡蛋清中溶菌酶的应用性研究[J].食品工业,2006,(3):19-20.[8]李敏.溶菌酶及其应用[M].生物学教学,2006,31(4):2-3.[9]荣晓花,凌沛学.溶菌酶的研究进展[J].中国生化药物杂志,1999,20(6):319-320.[10]宗柱，楚慧民，溶菌酶的应用前景和提取工艺，[J].农牧产品开发，1996，(4)，30-31[11]楼善贤，溶菌酶的研究进展，[J].浙江肿瘤通讯，1991，（4），48-52[12]韩学仁，韩治才，[J].禽产品加工，北京，轻工业出版社，1989，24[13]孙占田.蛋清中的溶菌酶，[J].国外畜牧科技.1999,26(6):47.[14]林亲录,马美湖.鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化[J].食品科学.2002,23(2):43-46.[15]贾向志,李元,马文煜，[J].生物技术通讯,2002,9:374.[16]中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国卫生部药品标准,生化药品,第一册,北京:北京科学出版社,1989:103.[17]马绪荣,苏德模主编.药品微生物学检验手册.北京:北京科学出版社,2000:68.