剪接因子PSF是一个大的复合体的一部分

剪接因子PSF是一个大的复合体的一部分，这个大的复合体是在前mRNA缺失的情况下组装成的，它包含了所有的五种snRNPs（PCC复合体能在缺失pre-mRNA的情况下形成，含有PSF和snRNPs）ABSTRACTPSF（polypyrimidinetractbindingprotein-associatedsplicingfactor，PSF蛋白是一种多功能的DNA/RNA结合蛋白，它能抑制原癌基因的表达，在人和小鼠中具有抑制肿瘤的作用）蛋白是一个很大的核蛋白，参与了包括转录、RNA剪接等众多生理过程。PSF蛋白被证实能直接与U5snRNA结合并且在许多被纯化了的剪接复合体中被发现。在这篇文章中，作者展示了当hela细胞核提取物处于适于剪接的条件下时，PSF蛋白被发现作为一个很大的复合体的一部分，这个复合体包含了五种snRNPs和大部分已知的剪接因子。在4℃下，不需要添加外源的pre-RNA该复合物就能形成，并且对盐离子敏感。沉降实验和通过质谱鉴定单独的组分揭示了该复合体附着有许多核内的因子，这些作用因子与剪接体组分重叠。INTRODUCTION大多数真核生物的基因都能被转录成pre-mRNA，pre-mRNA中含有被间隔序列（内含子）隔断的编码序列（外显子）。pre-mRNA的剪接过程就是在翻译之前，含子被有效且准确的切除，而外显子被连接起来。剪接过程包括两次连续的转酯反应。第一步转酯反应包括5’端剪接位点的断裂，产生一个与3’端内含子相连的套马索中间体。第二步反应中外显子被链接，内含子套马索被释放。剪接过程的执行需要剪接复合体，剪接复合体是一个由小核糖核蛋白颗粒（包括U1,U2,U4/U6和U5snRNAs及其他的非snRNP蛋白因子）组成的庞大复合体。snRNAs在剪接体的组装和两步转酯反应中发挥重要作用。外显子/内含子定界的准确性需要pre-mRNA、snRNAs和其他剪接因子之间的相互作用来实现。根据现有的细胞提取和体外剪接的研究，大多数现有的剪接体组装的模型都表明一条明确的途径，即需要ATP和pre-mRNA底物。剪接复合物的形成起始于U1snRNP识别5’剪接位点，然后U2snRNP辅助因子（U2AF）异质二聚物结合聚嘧啶区，由此形成独立元件早期复合体（Ecomplex）。U2AF结合聚嘧啶区能招募U2snRNP结合于分支点序列并形成Acomplex，当U4/U6、U5三snRNP加入进来，Acomplex转变为Bcomplex。伴随着一系列动态的RNA/蛋白重新排列，Bcomplex转变为Ccomplex，Ccomplex是一个短寿命的有活性的剪接体。每种独立的剪接复合体都经过不同的策略来纯化和分析。这些复合体都含有大量的snRNP和非snRNPC蛋白，这些组分参与了剪接位点的识别、剪接体的组装和调控剪接过程。近年来，对一些复合体的鉴定研究似乎与之前关于剪接复合体的形成相悖。这些复合体包括酵母Cwf/Cwc复合体、lnRNP复合体、一个大于150S的包含U2/U4/U5/U6的复合体，能与U2和U6配对、从啤酒发酵的酵母菌中提取的五snRNP、从Hela细胞核提取的五snRNP复合物。这些复合物间功能上的联系还需要进一步的研究，但是已经知道的是他们中的任何一种都不能单独地发挥剪接作用。PSF蛋白大小为100kDa，PSF蛋白在剪接过程的许多步骤中都发挥作用，但是其确切作用还有待研究。PSF蛋白能在剪接复合体的早期（H、A、B）、晚期（C）、U4/U6.U5三snRNP和U5snRNP中一起纯化出来，并且在核散斑中被发现，与许多剪接因子定位在一起。PSF蛋白的由一个N端富含甘氨酸的区域，一个富含脯氨酸/谷氨酰胺（P/Q）的区域，两个RNA识别基序（RRMs）和C端的两个细胞核定位信号组成。p54nrb蛋白（鼠同源蛋白）与PSF蛋白有十分相似的结构域并且能够结合PSF蛋白。PSF和p54nrb的结合能与RNA聚合酶II的C端结构域（CTD）相互作用，然后与转录/剪接复合体结合5’剪接位点，接着继续进行转录和剪接。除了参与剪接过程，PSF蛋白还参与了众多的细胞核内事件。PSF蛋白在许多情况下能作为转录调控因子，例如在调控生长因子来刺激基因表达，又可以作为共抑制因子通过Sin3A招募脱乙酰基酶（HDACs）然后诱导沉默，还能在cAMP的刺激下作为复合体的一部分激活人CYP17基因的启动子。PSF蛋白还能调控拓扑异构酶I的活性，或者作为间断的双链DNA修复因子，或者在细胞核中保留超编辑的RNA。最近的研究表明，PSF蛋白能抑制HIV-1gag/pol和envmRNAs的表达（典型的逆转录病毒的基因组的RNA基因组长度约为7000-10000个核苷酸，携带三个基因：gap(groupassociatedantigen),pol和env。gag基因编码病毒颗粒内的核心蛋白），包括基质、衣壳三个蛋白。pol基因编码蛋白酶、整合酶和逆转录酶。env基因编码被摸蛋白，病毒RNA经拼接翻译成一条多肽链，经蛋白酶切割后成2个蛋白，即表面蛋白和跨膜蛋白），通过顺式激活不稳定性原件（INS）来靶向降解。在之前的研究中，作者已经揭示了PSF蛋白和P54nrb与U5snRNA的相互作用。通过PSF特异的抗体进行免疫共沉淀实验（IP）来进一步分析这种相互作用，在这篇文章中，作者提取了Hela细胞处于剪接状态细胞核提取物并进行了五种UsnRNPs与PSF蛋白的co-IP实验（不考虑额外的pre-mRNA）。作者该状态的细胞核提取物在体外进行了沉淀分析实验，通过这个实验确定了在剪接过程中会形成一个包含PSF蛋白和多种sn-RNP的大型复合体。在这些复合物中，最大的复合体表现出非特异性的结合，然而作者分离出来一个稍小的包含PSF蛋白的复合体（PSF-containingcomplex，PCC），该复合体包含五种snRNPs而且其沉淀后的体积与成熟的剪接复合体十分相似。有趣的是该复合体在4℃形成并且其组装不需要外源的pre-mRNA，这表明形成该复合物很可能不需要ATP。通过质谱分析分析有/无pre-mRNA组装成的该复合体，揭示了该复合体组分中有十分相似的蛋白，但通过对剪接状态的细胞核提取物进行IP实验都没有检测到这些蛋白。作者的结果表明在哺乳动物细胞中大型预先形成的剪接复合体的存在。MATERIALSANDMETHODS体外转录与剪接体外转录剪接和剪接实验和之前报道的一致。对衍生自腺病毒的剪接底物RNA（AdML）用BamHI切割得到线状的RNA，然后用T7RNA连接酶转录得到正义链，用EcoRI没切后用SP6RNA连接酶得到反义链。在30℃时对Hela细胞核提取物进行体外剪接反应，在细胞核提取物的最后一步用BufferD透析（20mMTris,pH8,100mMKCl,0.2mMEDTA,0.5mMDTT,20%glycerol）。剪接条件是将提取物用12mMTris-HCl,pH7.9,60mMKCl,0.12mMEDTA,0.5mMATP,20mM磷酸肌酸,2mMMgCl2,and0.5mMDTT处理，区别是一组加入了5-10ng的pre-mRNA底物。剪接产物用15%的尿素（8M尿素）PAGE胶鉴定。剪接复合体在不同时间点的形成用4%native胶（不加SDS、巯基乙醇等变性剂，使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷）检测。PCC的形成Hela细胞核提取物用12mMTris-HCl,pH7.9,60mMKCl,0.12mMEDTA,0.5mMATP,20mM磷酸肌酸,2mMMgCl2,and0.5mMDTT处理为剪接条件，添加或不添加体外转录的pre-mRNA，然后在冰上或者30℃孵育0-15分钟。从Hela细胞核提取物中去除外源性的Poly（A）RNA300μl的Hela细胞核提取物用buffer500（20mMTris-HCl,pH7.9,500mMKCl,0.2mMEDTA,0.5mMDTT,and1mMPMSF）处理，在30℃下与10mgoligo-dT纤维素柱孵育30分钟。反应后的溶液进行离心，取上清液在4℃用bufferD（20mMTris-HCl,pH7.9,100mMKCl,0.2mMEDTA,0.5mMDTT,5%甘油）透析2小时。IP抗SPF偶联蛋白ASepharose如参考文献所述处理。30μl的Hela细胞核提取物（约150μg）处理成适于剪接状态形成PCC，作为对照，30μl的核提取物在用bufferD透析时用bufferD稀释来维持相同的蛋白浓度。孵育过后，用50μlIPbuffer（60%BufferD包含1mMPMSF和0.01%NP40）稀释，4℃摇床摇30分钟后最大转速离心30秒，去除沉淀。接着用200μl的IPbuffer进一步稀释，加入25μl的抗PSF偶联蛋白ASepharose于4℃下孵育1小时。孵育过后用低盐的washbuffer（20mMTris-HCl,pH7.9,100mMKCl,0.2mMEDTA,and0.005%NP-40）或者高盐的washbuffer（20mMTris-HCl,pH7.9,250mMKCl,0.2mMEDTA,and0.005%NP-40）洗三次。IP后的RNA通过石碳酸/氯仿从琼脂糖中提取出来，接着用8M15%的尿素-PAGE胶分离。剪接产物和snRNAs能通过磷相仪（phosphorimager，用于在宏阵列实验中检测放射性同位素磷的放射信号强度的实验设备）和银染的方法各自观察到。当用质谱分析大规模提纯的PCC时，90μl的核提取物应用75μl的抗偶联琼脂糖A（或者用等量的蛋白琼脂糖A作对为对照）进行每一步反应，IP过后的蛋白应用8M尿素-50mMTris-HCl（pH=8.0）洗脱.质谱分析用多维液相色谱和串联质谱法来确定PCC的蛋白组分的方法如参考文献所述。从串联质谱法得到的数据与美国国家生物技术信息中心的人的子集的非冗余蛋白质数据库进行比对。比对结果如参考文献所述。梯度沉淀PCC和剪接复合体适于剪接状态的Hela细胞核提取物（添加/不添加AdMLpre-mRNA）在30℃孵育15分钟以形成PCC。在沉淀分析实验中，每一步200μl的体积都要加10%-30%的蔗糖（或者5%-20%的甘油），这一梯度含有2mMMgCl2,0.5mMDTT,60%bufferD,1mMPMSF,5mMNaFand0.01%NP-40。在4℃用54000g离心3，4或者12.5小时，收集每一分层。RNA通过石碳酸/氯仿从每一层中提取出来后通过8M15%的尿素-PAGE胶分离。剪接产物和snRNAs能通过磷相仪和银染的方法各自观察到。各组分的蛋白可以通过10%的SDS-PAGE胶分离，转移到硝酸纤维素膜上，使用抗PSF的抗体或者抗U5-116的抗体检测。RESULTS在未添加外源pre-mRNA的情况下，对剪接状态的Hela细胞核提取物进行co-IP试验能得到所有的五种UsnRNPs。在之前的研究中，作者揭示了PSF和p54nrb能与U5snRNA上一个保守的茎环1b结合，当核提取物处于剪接状态时，能检测到这两种蛋白以及其他的U5特异性因子都募集到生物素标记的U5snRNAs上。当使用PSF特异性的抗体进一步研究它与U5snRNPA的作用时，作者发现五种snRNPs都会被IP沉淀下来，U1,U2,U4,U5和U6在IP后的颗粒中有着接近的化学计量。在IP试验中所用的核提取物中含有AdMLpre-mRNA。剪接底物和中间体与PSF的共沉淀能力与PSF与剪接复合体的共沉淀能力一致。出乎意料的是的当在剪接状态下不加入AdMLpre-mRNA，IP实验只能得到类似但不相同的结果。作为对照，对不在剪接状态的核提取物进行IP实验，只有U1和U2被PSF抗体沉淀下来。用bufferD透析核提取物，在调整为剪接状态的过程中，要降低盐离子的浓度，添加MgCl2和ATP再生系统。在调整到剪接状态中的每一个变量，作者都进行了实验检测其作用，并发现降低盐离子的浓度是其中区别最