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(一)基本原理分光光度法是利用物质对某种波长的光具有选择性吸收的特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。当一束单色光通过溶液时，一部分被吸收，一部分则透过溶液。设入射光强度为Io。，透射光强度为It，，则透光度T=It／Io，吸光度(A)或光密度(O．D)或称消光度(E)则可表示为A=-lgT。根据Lambert—Beer定律，吸光度与溶液的浓度成正比，与光束通过溶液的距离(即光程)成正比，用数学表达式表示为：A=KLC式中C代表该物质的浓度，L代表光程，一般以cm表示，K为摩尔消光系数，即当溶液浓度为lmol／l，光程为1cm时所测得的一定波长下的吸光度。由于单色光透过溶液时，不仅被待测物质所吸收，而且还被比色容器与溶剂以及其它试剂吸收一部分，这部分需用空白管消除(空白液的做法即用与样本相同的一切试剂，而不含被测定的物质)(二)波长的选择：波长的选择一般是选择待测物质最大吸收峰的波长(λmax)。因在λmax测定吸光度，敏感度最高。在吸收峰波长处测吸光度，波长变化影响最小；而在其他波长处，波长变化对吸光度影响大，甚至测得浓度一吸光度曲线不呈直线。选择测定某一溶液所需的波长，是可以用不同的波长作该溶液的吸收光谱曲线，从曲线上选择最适当的波长来进行这一溶液的测定工作，但是，在分析工作中，尚有个别情况，不能单凭此一原则，而应根据下列三个原则，进行实际试测，然后全面考虑利弊，再行选定。1．应使被测溶液有适当的光密度，一般而言，适当的光密度为0.1—0.7，而以0.2—0.6最理想。过低的光密度因仪器的读数误差而产生很大的相对误差，反之，过高的光密度则往往已超过直线范围而引入误差。2．应使干扰影响降低至最低限度。在反应中，如遇不易去除的干扰色泽，应选用对此干扰色泽最不灵敏的波长。3．应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线。(三)标准曲线的绘制1．标准曲线的作用(1)标准曲线又叫做校正曲线或工作曲线，它是比色分析法中不可缺少的步骤。从浓度——光密度直线的直线特性，可以判断所采用方法的呈色反应是否符合Lamben—Beer氏定律。(2)作多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作，仪器等误差的大小，从而确定该测定方法的可靠性。(3)从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度。(4)当进行大批样品分析时，可省略多次计算，从光密度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。2．标准曲线的作法(1)标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。(2)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2—3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。(3)标准曲线图的绘制：一般常用的是光密度一浓度标准曲线。①用普通方格纸作图。图纸最好是正方形(长：宽=l：1)或长方形(长：宽=3：2)，以横轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密度的全距也应占用相同的格数。在适当范围内配制各种不同浓度的标准液，求其光密度，绘制标准曲线，以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此座标标点。然后，将各座标点和原点联成一条线，若符合Lambert—Beer氏定律，则系通过原点的直线。②若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。③标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。④绘制标准曲线：一般应作二次或三次以上的平行测定，重复性良好曲线方可应用。⑤绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新绘制。⑥标准曲线横坐标的标度：从标准液的含量换算成待测液的浓度。