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动物实验及抗氧化实验概述•药物（Drug）是用于预防、治疗、诊断疾病和帮助机体恢复正常功能的物质。•药品质量的优劣直接影响到药品的安全性和有效性，关系到用药者的健康与生命安危。•食物、药物、毒物关系食物药物毒物•在医学教学、科研和医疗工作中，不论是从事基础医学还是临床医学或预防医学，都需要用实验动物来进行各种实验。通过对动物实验的观察、分析，来研究需要解决的问题，动物实验方法已成为研究工作中必不可少的重要手段。生命科学制药工业农业畜牧业环保行为科学军事国防医学动物实验医学动物实验实验动物模拟生理、病理特征观察揭示生命和疾病规律探索生命奥秘控制疾病延缓衰老推广实验动物基本知识•实验动物是指经人工培育，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确，来源清楚，可用于科学实验、药品、生物制品的生产和检定及其他科学研究的动物。•实验动物是医药学，生命科学研究的基础和重要支撑条件。实验动物分类•（一）遗传学分类•1、近交系动物：•一般称为纯系动物，经连续20代以上的全同胞兄妹交配（或者亲代与子亲交配）培育而成，近交系数大于99%。•近交系特点：•实验结果比较准确，误差小•近交系动物遗传背景明确，每个品系的生物学特性、生理学特点、易感病原等都有完整的背景材料•近交衰退，生活力弱，对生产环境要求高、产仔少、营养要求高。•如小鼠近交系：C57BL/6J、BALB/c、C3H、DBA等。•2、突变系动物：保有特殊的突变基因的品系动物，即正常染色体发生变异、具有各种遗传缺陷的品系动物。•突变系动物特点：变异的遗传基因等位点可遗传下去，或者即使没有明确的遗传基因等位点，但是经过淘汰和选拔后，仍能维持稳定的遗传性质。可以自然突变或是人工定向突变。•3、杂交群动物：又称异系杂交，是由不同品系杂交所产生的品系。两个不同近交系杂交所生的第一代动物称为杂交一代动物或F1代。•杂交群动物特点：个体间遗传均一，能取得一致的实验结果表现双亲的显状性状环境适应性强④具有杂种优势。•4、封闭群动物：又称远交系，在一定群体内，以非近亲交配方式育成的动物品系，连续15代以上不从外部引入新的动物种群，或者来源于近交系的种群，在封闭条件下至少经过4代繁殖的动物。同基因型：近交系动物、突变系动物、杂交F1代动物等不同基因：远交系动物和封闭群动物特性同基因型不同基因近交系F1代杂交动物封闭群F2系或杂种同基因性高高不高低纯合性高低低（可变性）低长期遗传稳定性高高低低可检定的客观指标高高中等低表型一致性高较高中等低独特性高较高中等低国际公布很广很广有限极有限背景资料多中等中等少•（二）按微生物学控制原理分类•无菌动物：就是指不能检出任何活的微生物和寄生虫的动物。•悉生动物：指机体内带着已知微生物（动物或植物）的动物。此种动物原是无菌动物，系人为的将指定微生物丛投给其体内，例如使大肠杆菌定居在无菌小鼠体内，在进行微生物检查时，仅能检出大肠杆菌。•无特定病原体动物：动物是指机体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物，但非特定的微生物和寄生虫是容许存在的。•普通动物：是未经积极的微生物学控制，普遍地饲养在开放卫生环境里的动物。•常用的实验动物主要包括：小鼠、大鼠、家兔、狗、猴、猪、山羊、绵羊、鸡、鸽子、鹌鹑、马、牛等。动物实验常用方法动物模型的含义对原形的某些特征进行模拟和刻画。通过对模型的实验研究，将结论类推到原形，从而达到认识原形的目的。模型动物模型中的“动物”：包括整体动物，也包括动物的某一部分，如器官、组织、细胞等。目前生物模型已经从动物、微生物发展到细胞，但是最基本、最常用的是动物模型，即以哺乳动物为主，如猴、狗、兔、猫、鼠等的动物模型。在人为因素的作用下，使实验动物接受一定的损伤，如机械、物理、化学、生物等因素，造成实验动物组织器官或全身一定的损害，出现类似于人类疾病状态下的机能、代谢或形态结构等方面的变化。人类特定病理状态的发生、发展和结局等规律模拟动物模型是医学动物实验中重要的方法疾病的预防、治疗，以及药物筛选、新药开发等从而观察实验依据人类的自然寿命应该是多少呢？？•根据生物学原理，人类的生理特点，人的自然寿命应该是120岁。实际上，能活到100岁以上的很少！人类衰老的原因是多方面的，包括自由基说，生理功能、代谢失调说，生物钟理论等。普遍认为自由基的氧化破坏是造成机体早衰及某些慢性疾病的主要原因。天然植物的抗氧化作用•1、自由基•自由基(freeradicals)是任何包含一个未成对电子的原子或原子团。未成对电子，指那些在原子或分子轨道中未与其它电子配对而独占一个轨道的电子，生物体内的自由基主要有超氧阴离子自由基(O2-•)、羟基自由基(•OH)、烷过氧基自由基(ROO•)和一氧化氮自由基(NO•)等。大量自由基生成损伤蛋白质DNA脂质导致心脑血管疾病N.S退行性改变帕金森病阿尔茨海默病老年性斑变及白内障糖尿病癌症炎症自身免疫性疾病如风湿、类风湿自由基与疾病的关系癌变过程中自由基氧化作用O2··OHH2O2激活原癌基因产物的大量异常表达细胞异常增殖癌变氧自由基几乎和人类大部分常见疾病都有关系,从死亡率最高的心脑血管疾病，到人类最恐惧的癌症，以及近年来对人类造成巨大威胁的艾滋病，无一不和氧自由基有着密切的关系。•2、天然植物的抗氧化成分•在生物体内活性氧不断地通过非酶反应与酶反应产生，但在抗氧化酶及外源性和内源性抗氧化剂的协同作用下不断地被清除，在生理情况下活性氧可维持于有利无害的极低水平。•多酚类物质•多酚类化合物的抗氧化作用是向脂质过氧化自由基(LOO•)提供一个电子而使之成为较稳定的过氧化脂质(LOOH)，而自身则成为酚氧自由基或其同系物。多酚类物质就其化学结构的不同，可分为单聚体和多聚体两大类。类黄酮物质是多酚类物质中种类最多、存在最广泛的物质，可进一步分为黄酮类、黄酮醇类等，大多数都有较强的抗自由基作用。•多糖•由10个或10个以上单糖基通过苷键(主要是缩醛结构)连接而成的直糖链或支糖链的聚糖称为多糖。•中药中的多糖具有抗氧化活性•人参多糖、黄芪多糖免疫增强作用•香菇、猪苓多糖抗肿瘤作用•银耳多糖保护肝细胞作用•芦荟多糖抗肿瘤和抗艾滋病毒作用•研究发现多糖可通过直接清除活性氧(ROS)、络合产生ROS所必需的金属离子等途径实现抗氧化作用。•皂苷•皂苷由甾体或三萜连接糖基组成，分子中含有较多的羟基，具有较大的极性，是中药中一类重要的活性物质，许多中药如人参、知母、麦门冬、柴胡、桔梗、红景天等均含有皂苷，是很好的抗氧化剂。•④其他•除了以上几大中药成分在自由基清除中起着重要作用外，其它具有抗氧化作用的成分包括：生物碱类、蛋白质、木质素、维生素类、鞣质类、蒽醌类和酶类以及微量元素等。生物碱类鞣质类蒽醌类维生素VC，VE及其衍生物等鸟氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸等五倍子、没食子、石榴果皮等蓼科、豆科、茜草科和低等植物地衣类和菌类的代谢产物•3、抗氧化剂活性测定方法•抗氧化剂抗氧化活性的测定方法有体内和体外两种方法。•体内抗氧化实验：体内评价抗氧化剂抗氧化活性的方法有动物实验和人体研究。•动物实验主要通过测量血液中和组织匀浆中脂质过氧化物（不饱和脂肪酸链经自由基或活性氧作用后形成带有过氧基的脂质）和SOD活性（肝蛋白）及含量来评价其抗氧化活性。•人体研究主要是考察一些已经批准生产的中药制剂在疾病治疗中对氧化作用的影响。•体内实验法比较灵敏，但与体外实验法相比周期长、成本大、实验繁琐，因此大量样品的抗氧化活性筛选仍有赖于体外实验法。•体外抗氧化实验：体外测定抗氧化剂的抗氧化活性主要表现在抑制脂质过氧化、清除自由基、抑制促氧化剂和还原能力等几方面。•评价抗氧化剂抑制脂质过氧化能力的方法主要有：•过氧化值法、共轭二烯氢过氧化物法、硫氰酸铁法、硫代巴比妥酸法(TBARS)等。•评价抗氧化剂抗自由基活性所用的自由基主要有：•OH、O2-•、DPPH•。•产生•OH的方法主要有：•离子辐射：辐射水可以产生•OH；•过氧化氢和金属离子的反应，典型的是Fenton反应：Fe2++H202→Fe3++•OH+OH-，Cu+和H202也可发生类似的反应：•由臭氧产生：臭氧在水溶液中，特别是在碱性条件下，可以生•OH。•产生O2-•的方法主要有：•邻苯三酚自氧化体系：邻苯三酚在碱性条件下能迅速氧化，生成并积累O2-•；•光照核黄素：光照核黄素EDTA体系可以产生很高浓•黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶(XO)体系可产生O2-•；•④甲硫氨酸作用于VB2可产生O2-•；•⑤二甲基亚砜在碱性条件下可产生O2-•；•⑥KO2在有机溶剂中可产生O2-•；•⑦辐射分解和光化学方法、电化学方法产生O2-•；•⑧多形核白细胞受到某些刺激时，产生呼吸爆发，能释放O2-•。•评价抗氧化剂还原能力的方法主要有：铁离子还原抗氧化剂能力法(FRAP)和高铁盐-铁氰化钾法等。•FRAP法原理：在低pH下，抗氧化剂将Fe3+-三吡啶三嗪还原成Fe2+-三吡啶三嗪，Fe2+-TPTZ呈蓝色，在593nm处有强吸收，测得吸光度值越大，说明还原能力越强；•高铁盐-铁氰化钾法原理：Fe3+被还原成Fe2+后，Fe2+与铁氰化钾生成可溶性蓝色配合物KFe[Fe(CN)6]，于700nm处有最大吸收，测得吸光度值越大，说明还原能力越强。•常见的体外抗氧化实验体系：•Fenton体系、邻苯三酚自氧化体系、DPPH•体系、还原体系、抗卵黄脂质过氧化体系•Fenton体系•采用比色法测定抗氧化类化合物对由Fenton体系产生•OH清除作用。•原理：Fenton反应产生•OH，将邻二氮菲-Fe2+水溶液氧化为邻二氮菲-Fe3+，导致邻二氮菲-Fe2+在536nm处的最大吸收峰消失，据此可推知体系中•OH数量的变化。•邻苯三酚自氧化体系•采用比色法测定丹酚酸类化合物对由邻苯三酚自氧化体系产生的O2-•清除作用•原理：邻苯三酚在碱性条件下能迅速氧化，不断生成并积累O2-•，同时生成在420nm处有强烈吸收的有色中间产物，吸光度在反应开始后一段时间内随时间变化呈线性增加，抗氧化物质的加入可以阻止中间产物的积累，据此可测定清除O2-•活性的大小。•DPPH•体系•DPPH•(二苯代苦味肼基自由基)是一种稳定的自由基，醇溶液呈紫色，在517nm处有吸收。•采用比色法测定丹酚酸类化合物对DPPH•的清除作用•原理：DPPH•在可见光区517nm有最大吸收峰，其乙醇溶液呈深紫色，当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系，因而可用比色法进行定量分析，来检测自由基清除情况，从而评价样品的抗氧化能力。其能力用清除率来表示，清除率越大，抗氧化能力越强。•卵黄脂蛋白PUFA过氧化体系•采用以Fe2+诱发卵黄磷脂C-2位上的极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)过不饱和脂肪酸(PUFA)的过氧化模型，用硫代巴比妥酸法测定丹酚酸类化合物的抗脂质过氧化作用，原理：脂质氧化生成的丙二醛(MDA)与硫代巴比妥酸(TBA)反应，生成在532～534nm处有最大吸收的红色物质，从吸光值可以推测脂质过氧化的程度。•还原体系•实验采用高铁盐-铁氰化钾比色法测定抗氧化剂类化合物的还原能力•原理：Fe3+被还原成Fe2+后，Fe2+与铁氰化钾生成可溶性蓝色配合物KFe[Fe(CN)6]，于700nm处有最大吸收，吸光度值越大，还原能力越强。