动物细胞培养

动物细胞培养第一章1.1动物细胞培养基本概念动物细胞培养技术：从机体中取出组织或细胞或利用已建立的细胞系（株），在待定的人工条件下使细胞在培养容器中生长或生产生物制品的一门技术。细胞培养泛指所有的体外培养。体外培养（cultureinvitro）是指将活体结构成分（如活体细胞、活体组织、活体器官等）甚至活的个体从体内或其寄生体内取出，置于类似于体内生存环境的体外环境中生长和发育的方法。就培养物而言，体外培养分为细胞培养、组织培养和器官培养。细胞培养（cellculture）是指在体外条件下，用培养液维持细胞生长与增殖的技术。组织培养（tissueculture）是指从机体分离出的组织或细胞在体外人工条件下培养生长的技术。器官培养（organculture）指的是将部分或整体器官在不损伤正常组织结构的条件下进行的培养，即仍保持组织的三维结构，并模仿在各种状态下的器官功能。体外培养优点：理化环境可精确调控，生理条件相对恒定；对于同一来源的组织样品，随着传代进行，细胞系逐渐趋于均一；培养过程经济有效且可规模化；可模拟细胞体内环境。体外培养局限性：对操作者的专业技术技能要求高；能获得的细胞量较少（实验室：1-10g细胞/批，企业：100g细胞/批）；培养过程中易出现细胞去分化和选择性培养的现象；在传代培养中需对细胞进行鉴定并调节培养条件；培养细胞的不稳定性（染色体组成不稳定、去分化、转化等）。体内外培养细胞的差异和原因：体内外培养的差异：功能差异：在体外培养条件下，细胞降低甚至丧失了其在体内的合成、分泌等功能，即细胞分化特性减弱或不显。生长和增殖差异：细胞在生长方式、移行方向、增殖能力等方面改变。体内细胞所处微环境：由细胞本身、支持细胞胞外基质、可溶性分子、用力、毛细血管以及神经等要素构成，调控着细胞在体内的命运。体内外培养细胞的差异的原因：失去体内神经系统和内分泌系统对功能细胞的调节作用；丧失支持细胞与功能细胞的相互作用；缺少支持物（细胞外基质）对功能细胞的作用；改变功能细胞生长繁殖的三维几何空间环境；缺乏功能细胞生长繁殖所需的应力等物理因素。——需要理解和认识细胞特性和所处的微环境，通过优化细胞外培养环境，使细胞更好地生长、实现功能，生产生物制品。1.2现代动物细胞培养技术的建立结论：离体的动物组织在培养条件下具有近乎无限的生长和繁殖的能力，组织培养是研究组织和细胞的极好方法。培养技术：胰酶消化——建立细胞系——单层细胞单细胞分离培养——克隆细胞株灌流小室——更新培养基——间歇换液培养——灌注培养培养装置：卡氏瓶——试管——培养瓶——滚瓶——反应器培养基：天然培养基——人工合成培养基含血清培养基——无血清培养基——低蛋白、无蛋白培养基1.3动物细胞培养的产品细胞培养可以：生产细胞因子、酶、抗体等蛋白制品；生产病毒疫苗、病毒载体等；生产干细胞、成体细胞或组织等制品；体外分析、药物筛选等模型和基础研究。动物细胞表达药物成为生物医药发展主流投放市场以及临床中试的重组蛋白有70%由哺乳动物细胞培养表达。治疗性抗体药物均采用动物细胞大规模培养方式生产。国内疫苗生产现状：生产方式：滚瓶机细胞株：鸡胚或原代细胞培养基：需添加10%血清缺点：批量小、批间差异大、质量不稳定、劳动强度大、占用场地多、效率低等工程化组织体外构建中存在的问题：构建过程中需要手工操作；培养条件无法控制；过程参数无法检测；对组织构建过程中环境要求知之甚少；过程放大受到限制——严重制约组织工程产品研制及未来规模化工业化生产第二章2.1细胞成分和化学环境人体的细胞组成：据统计，成人有机体大约有1014个细胞，刚出生的婴儿大约有1012个细胞；1g哺乳动物的肝或肾组织大约有2.5~3亿个细胞；人体中大约有200多种不同类型的细胞，根据其分化程度可分为600多种，它们的形态结构与功能差别都很大，但是都是由一份受精卵通过分裂与分化而来；大多数细胞在培养时大约直径在12-18µm；某些类型的干细胞相当小，且只有少量的细胞质；与此相反，在肝脏内的某些细胞（如肝细胞）是相当大，平均直径为20µm的细胞。案例一：MSCs群体大致可分为两种：（1）RS细胞：形态细态（7μm），增殖迅速，扩增能力较弱，克隆形成能力高；（2）成熟干细胞：形态宽大，扩增能力较弱，不具克隆形成能力。案例二：从骨髓里分选出verysmallembryonic-likestemcells（VSELs）直径：VSELs:3.630.09μm，HSCs:6.540.17μm；核/质比：VSELs：1.5，HSCs：0.8细胞质面积：VSELs：6μm2，HSCs：35μm2水：占尽80%；蛋白占10~20%。碳水化合物是细胞物质和能量基础，形成能量代谢的中间体，作为核苷酸一部分，组成糖蛋白，糖脂等，游离的碳水化合物较少脂组成细胞各种生物膜（细胞膜和细胞内膜）哺乳动物细胞单倍体基因组的大小是约3Gbp，对二倍体细胞而言相当于约5pg的DNA；RNA比DNA更丰富，包括mRNA、rRNA（占RNA90%以上）及其他RNA。胞内和胞外流体中离子浓度血浆（mmol/L）间液（mmol/L）胞内（mmol/L）Na+14014K+44140Ca2+1110-4Mg2+0.80.720Cl-11011050细胞质中存在的所有矿物质占细胞干重约5%。一些离子在胞内与胞外的浓度差别很大，这些浓度梯度是维持细胞功能的关键。钾离子和钠离子在细胞膜两侧有十倍以上的浓度差，且浓度梯度呈相反方向，钾离子浓度远高于胞外，而钠离子浓度远高于胞内。胞内钙离子浓度较低总渗透压大约280mOsm，培养基的渗透压应与此处与同一水平，避免产生渗透压差。2.2细胞结构与功能2.2.1细胞膜结构：磷脂双分子层；成分：膜脂+膜蛋白流动镶嵌模型：膜的流动性，蛋白质和膜脂均可以侧向运动；膜的不对称性，蛋白质分布不对称。构成磷脂双分子层成分：磷脂（35-70%）；三种含甘油骨架：磷脂酰乙醇胺、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰胆碱；一种以丝氨酸为骨架：糖脂（10%），胆固醇（30%）。构成磷脂双分子层成分：磷脂：磷脂极性头、磷脂非极性尾（一个饱和的脂肪酸、一个顺式不饱和（C14-C24）脂肪酸）非极性尾作用：饱和脂肪酸允许更紧密的装填，不饱和脂肪酸双键创建了扭结，降低了装填密度，增加了流动性。糖脂：含糖而不含磷酸的脂类；神经细胞膜上神经节苷脂质含量较高，含有唾液酸；红细胞表面ABO血型糖脂。胆固醇：提高脂双层的力学稳定性，调节脂双层流动性，降低水溶性物质的通透性；细胞膜中胆固醇的含量较高，但细胞期末中非常低。膜蛋白：脂质：蛋白质=50:50（w/w），50:1（mol/mol）膜中蛋白质含量受组织来源、膜功能影响较大，具代谢活性的线粒体在其膜中含有75%（质量比）蛋白。蛋白分子以不同形式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面，膜蛋白赋予生物膜功能，尚未发现膜结构中起组织作用的蛋白；各种化学物质、电势、氧化还原电位跨膜梯度的维持是通过不同的膜蛋白完成的。膜的流动性：磷脂双分子层可处在凝胶状态或液晶状态影响膜流动性的因素：温度：温度降低，磷脂双分子层从液晶变为结晶态（或凝胶态）；脂肪酸：短链的、不饱和脂肪酸含量较高时增加了磷脂双分子层的流动性，并降低他的相转变温度；胆固醇：其作用是多方面的，与磷脂作用增加稳定性；是磷脂相互分开，防止磷脂由液相变为固相，促进流动；卵磷脂/鞘磷脂：该比例高，则膜流动性增加，是因为鞘磷脂的相变温度高于卵磷脂；其他因素：膜蛋白和膜脂的结合方式、温度、pH、离子强度等。细胞膜的功能：细胞功能区域化：为细胞生命活动提供相对稳定内环境；选择性物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接；质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。细胞膜与物质运输：大多数生物分子不能自由地进出细胞，即使是小分子的营养物质（如葡萄糖和氨基酸）无法迅速通过细胞膜以支持细胞生长；营养物质通过细胞膜需要特定的载体蛋白；细胞膜处于动态变化之中：细胞生长；膜更新，替换被氧化或损坏的脂分子；膜囊泡转移；分泌和内吞。磷脂双层膜是一种非共价结合的聚合物，由磷脂组装而成，因此，可以自由活动：迅速地扩大、缩小、断裂、融合细胞膜动态平衡：膜循环以维持平衡小结——细胞膜磷脂双分子层特性：磷脂双分子层是流动的，其流动性受温度、脂肪酸和胆固醇等因素影响；磷脂双分子层由磷脂、糖脂、胆固醇和蛋白构成；磷脂具四种类型结构，以甘油丝或丝氨酸为骨架；细胞膜处于动态变化之中。2.2细胞质细胞质中含有：各种细胞器和高粘度的的胞质液；胞质液中有可溶性的高浓度蛋白质（100-300mg/ml）、无机物、中间产物和代谢产物等；蛋白聚集体（像丙酮酸脱氢酶和核糖体）；细胞骨架网络分布在细胞质中。蛋白聚集体、酶的复合体、细胞骨架蛋白和细胞器使细胞质中显得非常拥挤，溶质非常稠密。细胞质功能：蛋白质和脂肪合成的重要场所，细胞内所有蛋白质合成的起始步骤都发生在细胞质基质的游离核糖体上；细胞与环境、细胞质与细胞核以及细胞器之间的物质运输、能量交换、信息传递等都要通过细胞质基质来完成；很多重要的中间代谢反应也发生在细胞质基中，糖酵解、磷酸戊糖途径、糖醛酸途径、糖原的合成与部分分解过程等；进行蛋白质修饰（磷酸化、糖基化、甲基化、酰基化）、泛素化和蛋白酶体介导的选择性降解、由热休克蛋白帮助蛋白质正确折叠。2.2.3细胞核细胞和功能：遗传物质储存和复制的场所，细胞遗传性和细胞代谢活动的控制中心；核基质中DNA复制和转录成mRNA，，转录因子核转录调控因子在细胞质中合成，然后被运送到细胞核中发挥作用；核被膜构成细胞核和细胞质之间的天然选择性屏障，核孔功能进行核质之间的物质交换与信息交流；核仁是核糖体的生物发生场所。包括rRNA的合成、加工和核糖体亚单位的装配，随后运送到细胞质参与蛋白质合成。核型与染色体显带核型：指染色体组在有丝分裂中期的表型，包括染色体数目、大小、形态特征的总和；核型模式图：讲一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像称为核型模式图，它代表一个物种的核型模式。染色体显带技术表观遗传修饰：表观遗传是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。表观遗传学的主要研究内容：基因转录过程的调控：DNA甲基化、组蛋白共价修饰、染色体重塑、基因沉默和RNA编辑基因转录后的调控两部分：基因组中的非编码RNA、微小RNA（miRNA）、反义RNA（antisenceRNA）、核糖开关（riboswitch）等表观遗传修饰组蛋白修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，调控基因转录中发挥着复杂的作用；DNACpG岛的甲基化，DNA甲基化主要是一直基因转录miRNAs的作用2.2.4线粒体细胞中数量醉倒的细胞器（大约1700/cell），占细胞总体积的20%，人体内的细胞每天合成的数千克ATP大约95%由线粒体产生超微结构：线粒体是由两层单位膜套叠热诚的封闭的囊状结构。一般呈粒状或杆状包括四个功能间隔：外膜、内膜、膜间隙、基质线粒体的主要功能：氧化磷酸化；合成ATP；为细胞的生命活动提供能量。糖、脂肪细胞质丙酮酸和脂肪酸线粒体乙酰CoA（三羧酸循环）氢通过电子传递链到达氧生成水，同时ADP磷酸化生成ATPNADH氧化泵出质子是逆质子和电荷梯度，而质子运动驱动ATP合成是顺质子和电荷梯度方向小结——线粒体线粒体是由两套单位膜组成的封闭的囊状结构通过氧化磷酸化合成ATP，为细胞的生命活动提供能量；2.2.5内质网内质网由封闭的管状或扁平囊状系统及其包被的腔形成互相沟通的三维网络结构内质网通常占细胞膜系统的一半左右内质网两种基本类型：粗面内质网（rER）和光面内质网（sER）ER的功能：ER是细胞内蛋白质与脂类合成的基地rER的功能：蛋白质合成（起始于