搜索
预习报告—第8组换液观察实验器材器材：酒精灯，镊子，酒精，酒精棉，胶头吸管，超净工作台，废液缸，打火机，显微镜，载玻片等。溶液：培养液。实验步骤一、无菌室准备1、实验环境无菌处理：（1）无菌室消毒：定期清洁，用过氧乙酸熏蒸，紫外线消毒1小时。（2）超净台消毒。（3）实验者准备：紫外灯关闭30min钟后，实验者在缓冲区内穿白大褂，戴口罩，帽子，洗手，泡手，（穿隔离衣），酒精擦手，拿好实验物品进入无菌室（洗手后手不要再碰缓冲区内其他物品，开门由未完成准备的同学帮忙）。2、无菌技术要领：（1）手指不可触及器材使用端；（2）器材使用端经火焰消毒使用；（3）打开或封闭瓶口，安装吸管等都必须在无菌区进行；（4）开口瓶必须顺风45°斜放，用后及时关闭。3.、实验器材无菌使用：（1）吸管使用：左手持筒，右手取下筒口包装，倒置于安全区内桌面。消毒筒口，左手抖动至吸管长处筒口，右手取管，左手消毒筒口，右手取筒口包装重新套于筒口，将吸管筒放置于远处。此过程中，右手吸管保持管口斜向外上，减小污染几率。吸管吸出液体不要太多，移液时要注意吸管口要保留一段空气柱。移液时吸管不要伸到瓶里放液，而是瓶口微斜，在瓶口外放液。二、超净台操作（一）换液1、台面准备：台面消毒，点燃酒精灯放在左前方，左手边放培养瓶，再往右依次摆放培养液、酒精棉瓶，废物瓶，最右是吸管，这样将所有的物品就在自己的面前。2、观察：观察培养瓶内细胞的生长情况，培养液的清亮度及其他情况（具体见下观察部分）3、镜下观察取材：培养瓶内培养液吸取几滴在载玻片上留作观察（吸管每用完要换掉）。4、去液：用镊子取酒精棉球放在台面上，左手持培养瓶，翻转使其细胞面朝上，取下盖子，瓶口消毒，5、吸液滴：将培养瓶瓶口垂直朝下，在桌面上的酒精棉球上轻轻压下，使酒精棉球将瓶口的液滴吸试完全。6、瓶口擦拭：左手持培养瓶，右手用镊子取酒精棉球，在培养瓶口处从上至下绕圈擦拭，将擦拭完的酒精棉球弃入废物瓶。7、加培养液：取吸管，套上胶头，另一位同学在安全区内将装有新培养液的培养瓶打开，瓶口消毒，由主操作者左手持培养瓶，将其侧立，右手使用吸管从另一位同学手中的培养瓶中吸取3ml的新培养液，沿侧面加入培养瓶。8、收尾：瓶盖瓶口消毒后盖上，培养瓶细胞面在上放回原位，新培养液瓶也消毒盖好，放置一边，进行下一位操作。（二）观察观察培养液的情况，细胞的生长情况，取载玻片进行镜下观察。1、观察培养液清亮度：培养液被污染时多数浑浊，少数清亮，常见污染有（1）细菌污染：培养液浑浊变黄（2）霉菌污染：多数培养液清亮变黄，镜下可见菌丝和孢子（3）念珠菌污染：液体清亮色黄，镜下见长短不一的菌链（4）酵母菌污染：液体浑浊色黄，镜下见成群的酵母菌（5）支原体污染：液体清亮，支原体分布在细胞表面和细胞之间除此之外还有螨虫污染等。我们可以依此简单判断培养液污染情况。2、培养细胞分型：体外培养的动物细胞有两型非贴壁依赖性细胞（又称悬浮生长型，如人淋巴细胞，k562细胞）、贴壁依赖性细胞（又称贴壁生长型）。贴壁依赖性细胞又大致分为以下四类：（1）成纤维细胞型，细胞梭形多突起，如心肌细胞，平滑肌细胞等（2）上皮细胞型，细胞扁平，多边形，如消化管上皮，肝胰上皮等，实验培养的小鼠细胞属于此种类型（3）游走细胞型，细胞有吞噬运动，如小鼠富强巨噬细胞（4）多型细胞型，如神经细胞本次实验小鼠肺细胞所属上皮细胞型，细胞应呈扁平不规则多边形，角为钝角，大小相仿，中央有圆形核。细胞外观透明，生长时成薄膜移动，紧密相连呈单层膜。我们可以依此为标准简单进行判断培养的细胞是否正确。3、培养细胞一代生长过程：从细胞接种到分离再培养，一般分为5个阶段：（1）游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态。（2）贴壁期：细胞贴壁后由圆球形细胞变为放射延展型细胞，进而过渡为极性细胞（3）潜伏期：有细胞活动，无细胞分裂，后期部分细胞进入细胞间期（4）指数生长期：细胞数成倍增长，增殖细胞近圆球形，体积较大，核大，易见双核细胞，正常细胞会出现接触抑制和密度抑制。（5）停止期：细胞长满瓶壁，不再增殖，时间长会发生中毒性改变。我们可以依此简单判断实验中培养的细胞所处时期。三、分工情况甲：乙：丙：三位同学依次进行换液操作，每人一瓶，中间的加培养液步骤由后一位同学进行协助。观察由三人共同观察讨论三瓶原代培养细胞的生长情况。