发酵工程期末总复习

发酵工程-期末总复习第一章概论1.现代发酵工业发酵定义是:利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制造微生物菌体本身,或其直接代谢产物及次级代谢产物的过程.2.应用范围微生物菌体:面包酵母,SCP微生物酶：糖化酶、蛋白酶、脂肪酶等。直接代谢产物(初级代谢产物):微生物生命活动中必需的代谢物.如氨基酸,维生素等.次级代谢产物:代谢过程中产生的,对一般生长活动并不必需的代谢物质,常在微生物停止生长以后才产生.如色素,毒素,抗生素等.微生物的生物转化：利用微生物产生的酶作用于化合物的局部结构。微生物消除环境污染微生物湿法冶金：利用微生物对某些金属氧化物的氧化还原反应。3.发酵的特点=微生物的特点+发酵工程的特点微生物的特点：体积小,面积大；吸收多,转化快；生长旺,繁殖快；适应强,易变异；分布广,种类多。发酵工程的特点：反应条件温和（常温常压）；原料来源广泛并无需精制；众多反应都在同一发酵罐内完成。4.发酵的基本条件要有某种合适的微生物或其它生物细胞；保证微生物能够进行代谢的各种条件(培养基,温度,溶解氧)；微生物发酵的场所；目的产物的提取和精制。5.发酵工艺组成部分种子培养、培养基制备、产物的提取精制、无菌空气、发酵罐。6.发展历程①古代发酵：只知现象,不知本质。米酒啤酒②近代发酵—纯培养技术的建立。酒精甘油丙酮-丁醇巴斯德发现了发酵是由微生物引起的,从而使传统的经验发酵变成了一门科学.布雷费尔德1872年创立了霉菌纯培养技术.汉逊1878年创立了酵母纯培养技术。科赫1881年创立了细菌纯培养技术.③现代发酵：通气搅拌发酵1929弗莱明完成了发酵技术的第二次技术转折；青霉素。代谢控制发酵1959木下祝郎发展完成了发酵技术的第三次转折；氨基酸、核苷酸。基因工程菌发酵1970以来引起发酵工程的技术革命；技术特点:可定向改造生物基因,按人们的意志生产产品；人生长素,干扰素,疫苗7.展望利用基因工程技术选育优良菌种；采用发酵技术大量培养高等动植物细胞；开发大型节能发酵装置,自动化将成为生产控制的主要手段；应用代谢控制技术生产各种代谢产物；发酵发生产单细胞蛋白，解决粮食危机。第二章工业微生物菌种选育1.育种的必要性发酵工业的目的是为人们提供各种各样的发酵产品，菌种的特性是发酵能否成功的关键，野生菌株不会积累过多的代谢产物，我们需要对野生菌株改造，使其符合人们的要求（高代谢产物及其它特性等）。2.育种方法自然选育、诱变育种、杂交育种、基因工程育种。3.菌种的筛选步骤采样﹑富集﹑分离﹑筛选﹑产物鉴别。①出发菌株采样：向菌中保藏机构购买或索取、向其它机构购买或索取、从自然界采样（包括从土壤中采样、根据微生物特点采样）。A.土壤采样：根据土壤有机质状况、土壤酸碱度和植被状况、地理条件、季节变化。除去表层5CM左右的土层,取5~25CM的土样10~15克(北方土壤干燥,可在10-30CM处取样),装入事先准备好的容器内,编号并记录地点﹑土壤质地﹑植被状况﹑取样时间及其它环境条件等.B.根据微生物的生理特点：产纤维素酶、产蛋白酶、产淀粉酶,糖化酶、以碳氢化合物为底物的菌种等。②富集培养：根据微生物的生理特点,设计一种选择性培养基,取样品少许加入培养基中,给目的微生物一个最适的生长环境,经过一定时间的培养,目的微生物在数量上占绝对优势,可有效地分离出所需要的菌株.③分离纯化分离,包括稀释分离法和划线分离法；组织分离法（常用于病变组织或特殊组织）；控制营养和培养条件。④诱变育种：包括诱变、筛选、优化环境条件。A.人工诱变育种的目的提高有效产物的产量;改善菌种特性提高产品质量;开发新品种.B.人工诱变育种的优点:能加速基因突变,可大大地提高突变株的数量.速度快﹑收效大﹑方法简单.C.诱变育种方法与步骤出发菌株的选择.菌悬液制备.诱变.突变株纯化及分离.产物活性测定.a.出发菌株的选择:选择具有一定生产能力或某种特性的菌株作出发菌株.选择纯种作出发菌株.选择菌株应考虑稳定性.采用多出发菌株.b.出发菌株的纯化将液体培养物或从斜面移接菌体细胞到0.9%生理盐水中,按10倍稀释法,逐一稀释到10-6~10-5,从适当浓度的稀释管中吸取0.1毫升,于事先准备好的琼脂平板上均匀涂抹,培养后,挑取一定数量(30~50个)菌落,进一步培养鉴定,最后确定遗传性状稳定菌株供诱变处理.c.单孢子菌悬液制备菌悬液要求:对进行诱变的菌体要保持同步,同时又要处在最旺盛的对数期.菌悬液制备方法(细菌):把经过20~24小时培养的新鲜斜面,移到装有基本培养基的三角瓶中,于37℃振动培养到对数期(16~18小时).接着于6℃培养1小时,使之同步生长.然后加入一定浓度的嘧啶和嘌呤继续培养20~60分钟.置于低温(约2℃)10分钟.离心洗涤.用生理盐水或缓冲溶液制备菌悬液.d.诱变物理诱变剂:紫外线X射线γ射线紫外诱变机理：引起DNA链上的两个嘧啶形成TT二聚体、嘧啶碱基或嘌呤碱基被氧化脱氨基作用、碱基中C-C键断裂，形成开环现象、核苷酸被击中后使碱基或磷酸酯游离出来、在DNA的链内或链间的碱基形成交联作用。紫外线诱发微生物突变的有效波长是200-300nm,最常用的波长是253.7nm.光复活作用：把紫外线照射的微生物暴露于可见光下,可明显降低死亡率的现象。原因是光激活酶获得光能后催化TT重新分解成单体.化学诱变剂：碱基类似物、烷化剂、脱氨剂、移码诱变剂。烷化剂诱变机理：具有一个或多个活性烷基,作用于DNA的碱基或磷酸部分,导致DNA分子结构变化,引起变异；与两个鸟嘌呤形成共价键,双功能烷化剂容易引起DNA双链的交联,引起变异或死亡.亚硝酸的诱变机理：主要是直接作用于正在复制或未复制的DNA分子,脱去碱基中的氨基变成酮基,影响氢键的形成,发生变异.移码诱变剂诱变机理：DNA双链上的两个碱基之间插入吖啶类化合物分子,使DNA链拉长,两碱基之间距离拉宽造成碱基插入或缺失,引起以后三联密码错位,导致移码突变.e.突变株分离和筛选微生物通过诱变因子处理,群体中产生各种突变体,其中有正突变﹑负突变和稳定型.需经过分离筛选,逐个挑出.突变是随机不定向的,但筛选是定向的.筛选的条件决定选育方向.常规筛选程序第一次诱变:出发菌株→诱变→分离在平皿上→挑选菌落(200个)→初筛(1瓶/株)→选取50株→复筛(3~5瓶/株)→选取3~5株(供下次做出发菌株).第二次诱变:取上述菌株4株→诱变→分离到平皿上→每株取100个菌落→初筛(1瓶/株)→复筛→选取3~5株供第三次诱变.筛选方法:随机筛选平板菌落预选法(根据形态变异、根据产物特性、浓度梯度法)4.菌种退化原因：基因突变、连续移代、环境条件预防：尽量减少传代、菌种纯化、采用良好的培养基和培养条件5.菌种保藏目的：保证菌种在一定时间内不死、不衰老、不污染、保持其原有特性。原理：挑选优良纯种菌、创造适合长期休眠的条件（低温、干燥、缺氧、避光）第三章发酵机制和代谢控制发酵1.发酵机制:微生物利用基质通过其代谢活动合成人们所需要产物的内在规律.代谢控制发酵:人为地改变微生物代谢调控机制(通过改变DNA)使有用中间或最终产物过量积累的技术.2.调控机制主要靠两个手段:酶生成量(反馈阻遏)/酶的活性(反馈抑制)。调控水平：DNA-mRAN-酶合成/酶蛋白的构象变化。原理：终产物与阻遏蛋白/酶变构部位结合。特点：慢、粗/快、精确。3.营养缺陷型菌株筛选①营养缺陷型：野生型菌株由于发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力,只有在基本培养基中加入缺失的因子才能生长的突变类型。②培养基类别基本培养基(MM):只能维持野生型菌株正常生长的培养基.补充培养基(SM):在基本培养基中加入该菌不能合成的生长因子后的培养基.完全培养基(CM):能满足各种营养缺陷型生长的培养基.③营养缺陷型菌株的分离和筛选诱发突变--淘汰野生型--检出缺陷型--鉴别缺陷种类④筛选（淘汰野生型）的方法细菌：青霉素（杀死生长繁殖着的细菌）酵母：制霉菌素（与真菌细胞膜上的甾醇作用）丝状菌：过滤法⑤营养缺陷型的检出点植对照法、影印法、夹层法⑥营养缺陷型生长谱的确定15因子、21因子。3.乙醇发酵①在无氧条件下,酵母或其它微生物酵解生成的丙酮酸，在丙酮酸脱羧酶的作用下脱羧生成乙醛,继而在乙醇脱氢酶的作用下,接受NADH的氢生成乙醇.CH3COCOOH→CH3CHO+CO2CH3CHO+2H+→CH3CH2OH总反应：C6H12O6→2CH3CH2OH+2CO2理论转化率：(2×46.05/180.1)×100%=51.1%②巴斯德效应：有氧条件下,酒精发酵和葡萄糖利用速度明显下降的现象。③三阶段a.前期发酵:酒母和糖化醪加入发酵罐后,由于醪液中含有一定的溶解氧和充足的营养物质,酵母能迅速生长到一定的水平.此时醪液中的糊精继续被糖化酶作用生成可发酵糖.26-28摄氏度b.主发酵:醪液中糖分迅速下降,酒精逐渐增多,CO2大量产生搅动酵母上下翻动与糖充分接触,使发酵进行得更彻底,发酵醪温度快速上升.30-34c.后发酵：此阶段的糖分大部分被消耗,发酵作用缓慢,温度逐渐下降.30-324.乳酸发酵①同型乳酸发酵:发酵产物中只有乳酸生成.理论转化率100%。异型乳酸发酵:发酵产物除乳酸外,还有乙醇和CO2生成.两者发酵菌种不同,发酵机制也不同.5.黄色短杆菌合成赖氨酸的调节机制①代谢优先生成高丝氨酸；代谢优先向蛋氨酸方向进行；蛋氨酸过量反馈阻遏酶4,3的合成；异亮氨酸过量反馈抑制酶5的活性；苏氨酸过量反馈抑制酶3的活性,并且与过量赖氨酸协同抑制酶1的活性。②积累赖氨酸的菌株：A)通过基因突变使酶3失去活性得到高丝氨酸营养缺陷型,切断向苏氨酸方向的代谢流.B)在培养液中加入限制量的高丝氨酸(或苏氨酸和蛋氨酸)6.积累肌苷酸IMP突变株选育选育腺嘌呤缺陷型或腺嘌呤+鸟嘌呤缺陷型或腺嘌呤+黄嘌呤缺缺陷型。7.谷氨酸棒杆菌合成谷氨酸的调控机制①野生型菌：谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量时，就会反馈抑制谷氨酸脱氢酶，使草酰乙酸转向合成天冬氨酸。天冬氨酸过量后，反馈抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，停止草酰乙酸的合成。正常情况下，谷氨酸无法积累。除非生成的谷氨酸不断排出细胞外。②理论转化率a。如果四碳二羧酸全部由乙酰辅酶A通过乙醛酸循环供给.则有:3C6H12O6→6丙酮酸→6乙酸+6CO26乙酸+2NH3+3O2→2C5H9O4N+2CO2+6H2O理论转化率=2×147/(3×180)×100%=54.4%b。如果四碳二羧酸全部由CO2固定获得,则1摩尔葡萄糖生成1摩尔的谷氨酸.C6H12O6+NH3+1.5O2→C5H9O4+CO2+3H2O理论转化率=147/180=81.7%③积累型菌的特点：a-酮戊二酸氧化能力微弱:a-酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低.谷氨酸脱氢酶活性强.还原性辅酶Ⅱ(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱.异柠檬酸裂解酶活力微弱.耐高糖耐高谷氨酸.CO2固定能力强.解除谷氨酸反馈抑制.具有向胞外分泌谷氨酸的能力.不利用谷氨酸.④谷氨酸的分泌是由细胞膜控制⑤控制细胞膜通透性的方法控制磷脂的合成控制细胞壁的合成选育温敏突变株A.生物素营养缺陷型作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Gly向膜外泄漏.控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10g/L).在发酵初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换.B.油酸营养缺陷型作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右.控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换.C.添加表面活性剂或不饱和脂肪酸机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细胞膜.关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂