变性梯度凝胶电泳技术的应用

环境污染与防治网络版第10期2008年10月1变性梯度凝胶电泳技术在废水生物处理领域中的应用*汪文斌1郑昱2朱亮3#（1.湖州市环境科学研究所，浙江湖州313000；2.湖州市能源监察支队，浙江湖州313000；3.浙江大学环境与资源学院，浙江杭州310029）摘要变性梯度凝胶电泳(DGGE)具有可靠性强、重复性好、操作便捷等特点，已被广泛应用于环境微生物领域群落结构多样性、动态分析以及功能菌群检测等领域。鉴于生物处理是目前废水处理处置中的主体工艺，通过DGGE技术研究来分析废水生物处理系统中的微生物种群多样性与群落结构动态演替，可对废水生物处理系统起到最优化设计与工程调控的指导作用。综述了DGGE技术在废水生物处理领域的研究与应用，并探讨了该技术在实际应用中存在的问题及其发展前景。关键词变性梯度凝胶电泳废水生物处理微生物群落结构ApplicationofDGGEinbiologicaldegradationforwastewatertreatmentWangWenbin1，ZhengYu2，ZhuLiang3(1.EnvironmentalScienceResearchInstitute,HuzhouZhejiang313000；2.EnergySourcesSupervisionDetachment,HuzhouZhejiang313000；3.CollegeofenvironmentalandresourcesciencesofZhejiangUniversity,HangzhouZhejiang310029)Abstract:Biologicaldegradationistheimportantprocessinwastewatertreatment.Accordingtodenaturingofgradientgelelectrophoresis(DGGE)analyzingofgeneticdiversityandmonitoringthedynamicofmicrobialcommunity,theproperwastewatertreatmentprocessescanbedesignedandcontrolled.TheapplicationofDGGEinstudyonbiologicaldegradationforwastewatertreatmentwasstrengthened.Inapplicationinmicrobialecology,theproblemsandprogressesofthetechnologywerediscussed.Keywords:denaturingofgradientgelelectrophoresis(DGGE)；biologicalwastewatertreatment；microbialcommunity生物处理是目前废水处理处置中的主体工艺，具有运行成本低、操作简便、出水水质好等优点，已被广泛应用于工业废水和城市污水的处理中。然而，废水生物处理工艺仍存在污泥膨胀、难降解有毒污染物导致处理系统崩溃、运行容易失稳等问题，因此深入了解废水生物处理系统主体——活性污泥及生物膜等的微生物生态系统的区系组成、动态变化以及功能菌群，解析群落结构、功能菌群丰度与系统运行性能之间的关系，已成为国内外学者的研究新热点[1，2]。微生物分离培养和显微镜技术等传统微生物学方法，在研究复杂的微生态系统过程中存在很大的局限性，不能全面、准确地表征微生物多样性、种群结构以及菌群演替等生态特性；而DNA指纹图谱，如变性梯度凝胶电泳（DGGE）[3]、温度梯度凝胶电泳（TGGE）[3]、单链构象多态性技术（SSCP）[4]、末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）[5]、扩增核糖体DNA限制性酶切片段分析（ARDRA）[6]等分子生物学技术的应用，大大拓宽了微生物分子生态学的研究视野，将废水生物处理领域的研究带入了一个革命性的新时代。近年来，DGGE技术因其可靠性高、分析速度快、操作简单等特点，广泛用于分析活性污泥、生物膜的微生物遗传多样性以及群落动态演替。本文在简述DGGE技术基本原理的基础1第一作者：汪文斌，男，1980年生，本科，工程师，主要从事环境影响评价和工业废水处理设计。#通讯作者。*国家自然科学基金资助项目(No.30470039)；高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(No.20050335133)。环境污染与防治网络版第10期2008年10月2上，对该技术在废水生物处理领域的应用研究进行了综述。1DGGE技术原理DGGE是由FISCHER和LERMAN创立的用于DNA突变检测的一种电泳技术，其原理是基于不同序列的DNA片段具有不同的双螺旋解链温度（Tm），DNA在变性剂浓度呈线性梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳到与Tm值相对应的变性剂浓度点时，双链DNA分子解旋变性导致电泳速度急剧下降，最终停留在凝胶中其相应的变性剂浓度位置，形成分散的条带。该技术可分辨具有相同或相近分子量的DNA片段序列差异，可达到一个核苷酸水平的突变检出率[7]。通常，DGGE分为垂直和水平两种电泳形式。垂直电泳是指变性剂梯度方向与电泳方向垂直，主要用于确定DNA片段分离的最佳变性剂梯度范围；水平电泳的变性剂梯度方向与电泳方向平行，根据垂直电泳确定的范围可进行多个样品的同时分析。DGGE技术主要步骤如下：①总DNA提取及纯化；②目标DNA片段PCR扩增；③确定最佳变性剂梯度范围、电泳时间和温度[8]；④PCR产物DGGE分析。2DGGE在废水生物处理微生物生态学研究中的应用进展1993年，MUYER等[9]率先报道将DGGE技术用于微生物群落结构研究，此后十多年，该技术广泛应用于微生物分子生态学的研究，笔者就其在废水生物处理领域的应用进展进行简要介绍。2.1污泥种群多样性分析目前，DGGE技术已广泛应用于环境样品的微生物群落结构或者特异种群多样性分析。LAPARA等[10]采用DGGE技术对七段法（4个高温处理过程和3个中温处理过程）生物处理制药废水过程微生物种群多样性进行了分析，结果表明，中温池污泥样品的指纹图谱条带丰度要明显高于高温池内的污泥样品，表明反应体系温度的升高会减少微生物多样性。KASONEN等[11]对处理含硫酸盐废水流化床反应器（FBR）内不同基质条件下的污泥微生物群落结构DGGE图谱分析发现，以乳酸为电子供体的FBR内污泥菌群结构要比以乙醇为电子供体更为复杂。DAR等[12]应用嵌套式PCR－DGGE技术分析活性污泥中硫酸盐还原菌（SRB）多样性发现，该技术可检测丰度较低的功能菌群，使其在环境样品分子生态监测中更具有实际意义。BOON等[13]采用嵌套式PCR－DGGE分析不同废水处理厂活性污泥菌群结构发现，活性污泥形态与易引起泡沫和污泥膨胀的Actinomycetes、氨氧化菌（AOB）及Acidobacterium等菌群的丰度差异和群落组成具有相关性。在此基础上，对DGGE图谱的目标条带进行割胶、回收、克隆测序可以获得更多基因水平上的遗传信息以进行开展系统发育分析，所测得的序列信息可设计寡核苷酸探针来进一步研究功能菌群空间结构。FANG等[14]首次对产酸反应器中的产氢颗粒污泥（HPG）进行DGGE图谱分析，发现HPG内菌群结构较为单一，基本以低G+C革兰氏阳性菌为主，环境污染与防治网络版第10期2008年10月3包括Clostridium、Bacillus、Staphylococcus、Papillibactercinnamivorans等。ZEIN等[15]研究生物浓缩反应器(BCR)处理含甲基叔丁基醚(MtBE)废水过程发现，该反应器内微生物种群多样性较丰富，包括α-、β-、γ-及δ-Proteobacteria等菌群，优势菌为Hyphomicrobium、Methylobacterium、Sphingomonas、Pseudomonas和Halomonas等，复杂的微生物群落结构保证了反应器稳定的污染物降解效率。JIANG等[16]应用DGGE研究发现，降解苯酚的活性污泥和颗粒污泥的群落结构相似性较低，共分离到10类苯酚降解优势菌，分属β-、γ-Proteobacteria和高G+C革兰氏阳性菌。JIANG等[17]应用FISH技术分析降解苯酚好氧颗粒污泥内PG-01菌株空间分布，以FITC标记EUB338、TRITC标记ARCH915和Cy5标记Pand822为探针，结果表明，细菌分布在整个颗粒区域，未检出古细菌，PG-01菌株主要分布在颗粒外表层。2.2微生物菌群结构动态演替多个样品的同步分析是DGGE技术应用于微生物分子生态研究的一大优势，有助于快速监测反应器启动过程污泥微生物微观生境变化，及时分析菌群结构随时间（季节）变化、环境因子影响等导致的动态演替。BOON等[18]应用DGGE技术监测了两组生物反应器内活性污泥在氯苯胺冲击负荷下的微生物相动态变化，结果发现接种有3-CA降解菌的生物强化反应器内微生物种群结构稳定，氨氧化菌的活性、丰度至第4天即开始恢复，而对照反应器内至第12天仍未见任何恢复迹象。LIU等[19]研究发现两相厌氧产酸反应器启动后pH急剧下降，并伴随挥发性脂肪酸（VFA）增加、产甲烷量降低、污泥解体洗出等现象，DGGE图谱显示13d后反应器内细菌种群结构开始稳定，最终两反应器内群落组成存在着差异，在高温（55℃）条件下细菌种群变化速率更快，厌氧消化反应器在高温条件更易建立。刑德峰等[20]应用双梯度－变性梯度凝胶电泳（DG－DGGE）监测生物产氢反应器微生物群落的动态变化和多样性，反应器启动初期微生物种群演替迅速，15d达到顶峰后逐渐减少趋于零，群落结构的多样性下降，相似性随着演替时间增加而升高，最后趋于稳定。傅以钢等[21]研究发现，城市污水处理系统在受到高浓度硝酸根离子冲击后微生物生态系统通过种群间协同作用恢复到原有的多样性，认为Bacillales和α-proteobacteria等优势菌群在处理过程中起着主要作用。STAMPER等[22]对可再生废水处理系统的种群结构动态演替研究发现，微生物种群的多样性随着BOD浓度的不同而变化。LAPARA等[23]探讨不同温度和操作条件对好氧生物废水处理过程中微生物群落结构和功能稳定性的影响，DGGE图谱揭示不同温度条件下均获得了独特的微生物菌群结构，并认为HRT同样是污泥菌群结构变化的调控因子之一。此外，TARTAKOVSKY等[24]采用HPLC化学分析技术，发现UASB对五氯酚降解菌的快速筛选过程相继将目标污染物转化为3,4,5-三氯酚、3,5-二氯酚、3-氯酚、苯酚，结合DGGE图谱分析发现反应器启动17d后出现Clostridiumacetobutylicum/C.beijerinckii.，TCP对位脱氯伴随有两个条带出现，属于Clostridium和Syntrophomonas/Syntrophobacter，DCP环境污染与防治网络版第10期2008年10月4的间位脱氯也伴随有Syntrophomonas和Syntrophus的出现，但这类菌也存在于对照反应器中，由此可推断PCP及其中间产物的还原脱氯应Clostridium作用所致。LI等[25]在好氧污泥颗粒化过程微生物动态分析实验中发现，污泥颗粒化过程微生物种群结构演替显著，随着污泥颗粒化而出现特异性条带。污泥颗粒化过程微生物群落结构动态演替显著，优势菌群分属β-,γ-Proteobacteria、Flavobacterium等类群。2.3污泥微生物群落结构研究虽然DGGE技术只能对微生物群落多样性、菌群种类进行分析鉴定，无法获得菌落形态、空间分布等信息，但结合荧光原位杂交（FISH）、点印迹杂交（Dot-blothybridization）等分子生物学技术，能够克服DGGE技术的局限性，进一步了解颗粒污泥、生物膜等特殊微生物系统的群落结构与功能。AHN等[26]研究了3组不同电子受体的SBR反应器（RAA反应器：O