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猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)控制问题解答一、PRRS病原1．蓝耳病的病原是什么？蓝耳病，又称猪繁殖与呼吸综合症（PRRS），其病原是猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）。该病毒是有囊膜的RNA病毒，属套式病毒目动脉炎病毒科。2．蓝耳病病毒的组成成分有哪些？PRRSV粒子呈球形，有囊膜，表面有纤突。病毒核衣壳呈二十面体对称，内含单股正链RNA。PRRSV的基因组约15KB，有8个开放阅读框（LRF），编码的蛋白包括复制酶、聚合蛋白和结构蛋白。ORF1编码复制酶和聚合蛋白,ORF1α编码的聚合蛋白经裂解后产生6个非结构蛋白（Nsp1α,Nsp1β和Nsp2-5）,其中Nsp2是最易发生变异的蛋白。迄今发现7种PRRSV结构蛋白，分别是核衣壳蛋白（N蛋白，ORF7编码）、非糖基化膜蛋白（M蛋白，ORF6编码）、GP2a、GP3、GP4、GP5四种糖基化囊膜蛋白（分别由ORF2—5编码）以及最新发现的GP2b蛋白。GP5、N蛋白是PRRSV主要的结构蛋白，其中N蛋白具有很多抗原表位，是刺激机体最早产生抗体的蛋白，但这些抗体不具中和作用，在诊断和血清学调查上的价值很大；GP5是产生主要中和抗体的抗原，但其抗原表位不是病毒的免疫优势表位，此外，发现GP3和GP4还含有中和表位。PRRSV的变异性很强，其中，GP5、Nsp2是PRRSV最易发生变异的蛋白，GP5的变异表现在氨基酸序列的变化、糖基化位点的缺失和修饰、氨基酸缺失等方面。我国已发现Nsp2变异的高致病性毒株，主要表现为两个位点共30个氨基酸的缺失，482位氨基酸上的保守亮氨酸缺失，534到562位连续缺失29位氨基酸。3．PPRSV在环境中能存活多长时间。PPRSV是一种有囊膜的病毒，在环境中不稳定，对干燥尤其敏感。对热和酸、碱敏感，在环境中不会长时间存在。在-700C至-200C可存活数月至数年；血清40C存72h有85%的样品可分离到病毒。对热敏感，在200C到210C条件下，1—6天内病毒具有感染力；在370C，感染力仅能保持3—24小时；560C，仅保持6—20分钟。酸碱也影响病毒活力，PH值低于6或高于7.5，病毒感染力迅速丧失。这种敏感性造成以下现象：在PRRS流行期间，并不能持续地从流产胎儿和死胎中分离出病毒。用于病毒分离的血清和组织样品应保存在-200C或40C条件下，以保护样品中PRRSV病毒的感染性。4．怎样分离PRRSV？PRRSV可在原代猪肺巨噬细胞（PAM），传代细胞系CL2621和Marc145中生长增殖。在每种细胞中，病毒呈杀细胞复制，引起细胞变圆、成堆和核固缩，感染细胞最终从培养瓶上脱落。各种毒株对PAM均有很强的适应性，因为PAM是病毒最重要的靶细胞，病毒最初的分离就是用PAM获得的。所以用PAM能比较容易的分离野毒株。5．PRRSV对哪些消毒剂敏感？普通消毒剂、洗涤济易将PRRSV灭活。氯仿和乙醚等脂溶剂可灭活PRRSV。在低浓度的去污剂溶液中，PRRSV很不稳定，病毒囊膜被破坏，释放出无感染性的核心粒子并丧失感染性。在室温条件下，氯仿（0.03%）可在10分钟内完全灭活PRRSV，碘（0.0075%）或季铵化合物（0.0063%）只需用1分钟。有研究表明交通工具的清洁、清洗、消毒和干燥都有助于灭活PRRSV。二、PRRS发病机制6．PRRSV是如何感染猪只的？蓝耳病病毒经吸入、摄食、交配、咬伤或针头传播进入机体后，在粘膜、肺、局部巨噬细胞中复制。此外，病毒还可经污染的精液进入子宫而感染母猪。感染发生12小时以内，病毒到达局部淋巴结，而后形成病毒血症。随后扩散到全身的单核细胞和组织巨噬细胞中，进而引起临床症状。7．PRRSV是如何持续感染猪只的？病毒可在猪肺泡巨噬细胞或淋巴细胞内复制增殖几个月，但被感染动物不表现明显的临床症状。这也是PRRSV感染最为重要的流行病学特征。有试验显示母猪感染PRRSV99天后仍能将该病传播给易感猪。妊娠90天子宫内感染，在分娩后132天仍能从仔猪的扁桃体和淋巴细胞结内分离到病毒。持续感染与感染时的猪龄无关。无论是胎儿、青年猪还是成年猪均会发生持续感染，病毒不被免疫系统识别而持续存在，但其逃避免疫的方式可能不是不断的病毒变异。有研究者发现PRRSV持续感染猪体内的病毒变异较少。8．目前我国流行的PRRSV毒株变异程度如何？不同毒株同时存在会否发生重组？作为RNA病毒，PRRSV的基因在合成时容易出现内在性错误，可出现点突变、删除、添加和毒株间基因重组，因此PRRSV的基因容易发生变异。但迄今为止在中国仅发现美洲株PRRSV，但各地分离到的不同毒株的基因组存在广泛变异，其毒力各不相同。但根据毒株的致病力不同，可将其分为弱毒力、中等毒力的强毒力毒株。弱毒力毒株不导致或导致不严重的临床症状，中毒力毒株会导致母猪流产和仔猪呼吸困难，强毒力毒株则会导致猪只死亡（当然，目前尚没有严格的毒力强弱的界定条件）。蓝耳病病毒不会像流感病毒那么容易进行重组。实验证明两种毒株同时进入一个机体后，其中一个将逐渐占优势地位，成为唯一能够繁殖的毒株，而另外的毒株则最终消失，但机理尚不太清楚。并且两个毒株的差异越大，两者之间不相容的程度就越高。9．猪场引入不同的PRRSV毒株，有何危害？这种情况比较常见，尤其是在频繁引种的猪场。在一个PRRSV阳性的稳定猪场，病毒的感染和机体的免疫力达到了某种平衡，生产成绩稳定。不相关猪群的PRRS病毒毒株有很大的不同，它们对免疫抵抗力的敏感性也有显著差异。与原有毒株不同的PRRSV毒株可避免机体原有的免疫力，从而打破原有毒株的平衡，致使猪场再次发病。10．高致病性PRRSV是引发“高热病”的元凶？田克恭等对“高热病”猪病料进行可疑病原扩培，在培养物中均可通过电镜观察到病毒。使用针对PRRSV独特基因片段的特异性引物进行PCR，可以扩增到PRRSV的许多分子标志。随后采用特异性PRRSV单克隆抗体进行免疫组织化学试验，结果出现明显的染色，显示存在PRRSV抗原。采用三株不同的高致病性PRRSV分离株（JXA1，HEB1，HUB2）对SPF猪攻毒。静脉注射攻毒的猪在6—8天内死亡，鼻腔接种的试验猪3—6天内出现明显“高热病”症状，攻毒后10天死亡。剖检试验猪可观察到与“高热病”病死猪相同的病变，且从感染猪上成功分离到接种毒株。最终确定高致病性PRRSV是“高热病”的主要病原。三、PRRS免疫11.机体免疫系统对PRRSV感染有何反应?:与其它病毒不同,蓝耳病病毒可在不启动天然免疫反应的情况下“悄悄地”感染所有年龄的猪。症次免疫反应失败导致机体的抗病毒防御机制反应慢或滞后。由于不能快速的刺激T细胞和B细胞反应，因此无法产生充足有效的抗体和细胞毒性T细胞反应。特异性lgM和lgG分别于感染后7天和14天出现，但产生中和抗体的时间则延迟4—5周。细胞免疫方面，PRRSV感染巨噬细胞和树突状细胞，引起巨噬细胞聚集组织的急性长期持续感染。这种感染可使部分猪终生带毒并不断排毒，进而使得整个猪群发生循环感染。此外，作为一种RNA病毒，PRRSV的遗传变异格外多，所以针对PRRSV免疫力不足的问题显得尤为突出。12．疫苗毒株与感染的蓝耳病野毒毒株的同源性和免疫原性有什么关系？蓝耳病病毒的同源性指两个或更多不同蓝耳病毒株间基因序列（多为一段基因）的差异度，同源性越高，说明两个毒株之间的变异越小。按常识理解，疫苗毒株与猪场里蓝耳病野毒株的同源性越高（高于70%），免疫保护率越好。但对此也存在争议。PRRSV含有多种抗原，包括糖基化蛋白（GP2a、GP2b、GP3—5）、非糖基化蛋白（M蛋白）、核衣壳蛋白（N蛋白）、还有病毒复制过程中产生的复制酶和聚合蛋白等。不同抗原在诱导免疫反应中的作用不同，如N蛋白诱导产生最早的抗体，但不具有中和作用；GP5诱导产生中和抗体。但对PRRSV免疫尤为重要的细胞免疫是由哪部分抗原诱导的，现在尚不清楚。因此不能简单的以一个或几个基因或开放阅读框的同源性来衡量免疫原性。13．什么是抗体依赖增强作用（antibodydependentenhancement,ADE）?体外培养的实验中发现，在有蓝耳病病毒抗血清存在的情况下，蓝耳病病毒感染肺泡巨噬细胞的能力被显著提高；在攻毒前若给猪注射中和抗体，病毒血症的平均水平和持续时间比单独注射病毒的猪要严重得多。可以推测，一定低水平抗体也许会增强蓝耳病病毒在巨细胞中的复制，即抗体在一定程度上引起了有害且没有保护力的应答反应。这种反应称为抗体依赖增强作用（ADE）。有研究者推测其原因为抗体结合病毒后，抗体—病毒复合物被巨噬细胞的Fc受体识别，在某种程度上加速了病毒对巨噬细胞的侵染，进一步加重了感染的严重程度。在ADE中，一定血清抗体水平不但不能中和病毒，反而会提高感染的严重程度。ADE在蓝耳病自然感染中的作用还没有确定。14．PRRSV感染后何时产生中和抗体？感染2周左右，慢慢开始产生中和抗体，可维持较长时间，但抗体水平很低。不同个体的中和抗体反应有很大差异，也可能不出现中和抗体，中和抗体中包括抗糖蛋白GP4和GP5的，以及针对膜蛋白（M蛋白）的。生成的抗体中还包括复制酶复合物中非结构蛋白的抗体，尤其是Nsp2多肽。这些蛋白可能是T细胞反应重要的靶蛋白。15．中和抗体发挥什么作用？通常情况下体液免疫在抵抗感染，阻断或减少动物间的病毒传播中发挥重要作用，因为中和抗体能够清除循环中的病毒。然而，对血中中和抗体和感染性PRRSV水平的检测结果却提示中和抗体在抵抗感染的作用可能很复杂。病毒血症发生在中和抗体出现之前。通常所产生的中和抗体不足以控制病毒复制，不但不能发挥保护作用甚至可能有害。肺和血中中和抗体水平变化相对滞后于肺和血中病毒载量的变化。肺部病毒载量在感染后7—9天达到高峰，血中则为感染后4天，比中和抗体出现的时间早2周。由此看来，中和抗体在PRRSV特异的获得性免疫反应中发挥第二位的作用（secondaryrole）。16．蓝耳病感染后何时发生细胞免疫？据报道，PRRSV感染后第28天出现抗原特异性的淋巴细胞增生，在第49天达到高峰，第77天出现下降，重复感染后细胞增生反应的幅度加大。这种增生性反应可被抗CD4+及MHCII类搞原的抗体所阻断，这表明这种增生性反应地CD4+及T淋巴细胞依赖性的，PRRSV感染可产生Th1细胞介导的免疫反应，其感染程度也受CD8+反应的影响。在自然感染PRRSV的猪体内可看到淋巴细胞亚群发生了变化，外周血中CD4+/CD8+细胞的比例明显降低，但由于PRRSV常常与继发感染有密切的关系，因此，PRRSV并非总是诱导产生这样的变化，而由于毒株的来源及毒力的差异，所以不同报道结果也不尽一致，有的甚至产生相反的结果，如Zhou等（1992）报道，PRRSV可引起小猪CD4+细胞数量增加，而CD8+细胞数量减少。17．细胞免疫具有什么作用？PRRSV的T细胞反应短暂且不稳定，发生于病毒血症高峰或无病毒血症时，有的不明显，有的很强。Xiao等（2004）发现急性感染和持续感染时病毒特异性T细胞的数目有很大差异，并且与病毒数量无关。除扁桃体以外的其他二级淋巴器官中抗原特异T细胞数量无显著差异，扁桃体中反应细胞数量无关。PRRSV感染后CD4+和CD8+T细胞的出现频度无变化，但γ/δT细胞数目降低。巨噬细胞作为PRRSV的靶细胞在所有组织中均有不同水平的存在，但与局部病毒载量不成比例。PRRSV的持续感染可能是造成T细胞反应较弱的原因，提示PRRSV抑制T细胞识别被感染的巨噬细胞。Meir等（2003）观察到初始T细胞T细胞反应弱且短暂，但感染后的1—2年内会不断上升。18．蓝耳病免疫中中和抗体和细胞毒性T细胞是否扮演主要角色？尚不清楚中和抗体和细胞毒性T细胞在保护力中是否扮演主要角色，也不清楚其在自然条件下的再感染中是否起到关键作用。提供PRRSV保护力的可能不是获得性免疫而是其它因素，如病毒感染的靶巨噬细胞（permissivemacrophages）的变化。乳酸脱氢酶升高病毒，鼠动脉病毒可诱导无效的中和抗体和细胞毒性T细胞反应