叶绿体色素的提取分离及其性质的测定

叶绿体色素的提取分离及其性质的测定南京晓庄学院生命科学系实验目的了解叶绿素提取分离的原理以及它们的光学特性在光合作用中的意义。实验原理叶绿体色素是植物吸收太阳能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素组成，根据它们在有机溶剂中的溶解度不同以及在吸附剂上的吸附能力不同，将它们彼此分开。叶绿素和类胡萝卜素都有光学活性，表现出一定的吸收光谱可用分光光度镜检查或用分光光度计精确测定（OD值）。实验材料和仪器实验仪器：大试管，台天平，研钵，量筒，烧杯，漏斗，滤纸，毛细滴管，剪刀，分光光度计，培养皿。实验试剂：丙酮，甲醇，醋酸酮，盐酸，氢氧化钾，石英沙，碳酸钙，无水硫酸钠，四氢化碳，乙醚。实验材料：新鲜植物叶片（菠菜）。实验步骤叶绿色素的提取称取新鲜菠菜叶片2克，去脉，放入研钵中加丙酮5ml，少许碳酸钙和石英沙，研磨或匀浆，再加入丙酮10ml，以漏斗过滤之，即为色素提取叶液。放入暗处备用。观察叶绿体色素的荧光反映现象取上述色素丙酮提取液少许于试管中，分别观察在反射光和投射光一侧，提取液的颜色有无不同。反射光侧观察到的血红色，即为叶绿素产生的荧光颜色。铜代反映取色素丙酮提取液少许于试管中一滴一滴加浓盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去Mg叶绿素，然后加醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液，则会产生鲜亮的绿色，此时形成了铜代叶绿素。点样展层，分离叶绿体色素1.准备：取宽约1cm，长约10cm的长方形滤纸条，将其卷成圆筒状，再取一张圆形滤纸，在其中间挖一个小孔。2.点样：用毛细吸管吸取叶绿体色素提取液，滴进上述圆筒中心。每滴一管待提取液干了，再滴下一管。3.分离：选取底面直径比步骤1中的圆筒滤纸片直径略小的培养皿，倒入适量层析液。然后将圆筒插入滤纸片的小孔中，滴加叶绿体提取液的一端应与圆筒保持相平，将滤纸放于培养皿的开口处，观察色素分离现象。叶绿素含量的测定取1ml上述提取液，以80%丙酮稀释20倍。然后一80%丙酮为对照，分别测定663nm，645nm处的光密度值。按相关公式分别计算色素提取液中的叶绿素a，叶绿素b的含量。再根据稀释倍数分别计算每克叶片中色素的含量。实验结果荧光现象在投射光一侧观察到提取液的颜色为绿色，而在反色光一侧则观察到血红铜代反应在加入数滴浓盐酸后，提取液呈褐色；后加入醋酸铜晶体，加热观察到了鲜亮的绿色。分离结果叶绿素含量测定测定结果：OD645=0.266OD663=0.591Ca=12.7OD663-2.69OD645得Ca=6.79mg/lCb=22.9OD645-4.68OD663得Cb=3.33mg/lCT=Ca+Cb=10.12mg/l所以1ml提取液中的叶绿素含量Nt=CT*V*稀释倍数＝10.12mg/l*1ml*20=0.202mg其中叶绿素a含量na=6.79*1*20=0.136mg叶绿素bNb=0.66mg所以每克鲜叶片中,叶绿素a的含量为1.02mg/g叶绿素b的含量为0.495mg/g所以叶绿素含量为：1.516mg/g注意事项1.称取的新鲜绿叶,尽量去除叶脉,满足2克叶绿体中有充分的叶绿素.2.研磨时要加入CaCO3,因为它能调节液体的,防止叶绿素被破坏.3.研磨时要注意加入石英砂,因为这样可充分研磨破坏叶表皮,色素能被充分提取.4.分离叶绿素时,点样的纸卷不宜过细,两端要平整,保证叶绿素扩展速度均匀等;保证色素扩展清晰,应多点样几次,大约20次左右.