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叶绿体色素的提取及理化性质的鉴定授课人:廖鹏飞一、实验目的及要求掌握提取和分离叶绿体中色素的方法了解叶绿素的物理和化学性质二、相关知识和实验原理高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a、叶绿素b、β−胡萝卜素和叶黄素四种。表6-1高等植物体内叶绿体色素的种类、颜色及含量色素名称项目叶绿素类胡萝卜素叶绿素a叶绿素bβ−胡萝卜素叶黄素颜色蓝绿色黄绿色橙黄色黄色在叶绿体内各色素含量比例312131叶绿素(Chlorophylls)是叶绿酸的酯，它在植物进行光合作用中吸收可见光，并将光能转变为化学能。叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a（C55H72O5N4Mg）和叶绿素b（C55H70O6N4Mg）两种结构相似的形式存在，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的醛基所取代。叶绿素的基本结构见图6-1NNNNMgCO2CH3CH2OCHH3CH3CRCH2CH3CH3CH2CH2COOCH3CH3CH3CH3CH3叶绿素a(R=CH3)叶绿素b(R=CHO)在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环，它们由四个甲烯基联结成卟啉环，在卟啉环中央有一个镁原子，它以两个共价键和两个配位键与四个吡咯环的氮原子结合成内配盐，形成镁卟啉。在叶绿素分子中还有两个羧基，其中一个与甲醇酯化成COOCH3，另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长链。脂溶性:卟啉环头部呈极性,具亲水性;叶醇尾部具亲脂性,难溶于水,仅溶于酒精、丙酮、已醚、已烷等有机溶剂。光学特性（1）吸收光谱：色素溶液随波长改变而发生光吸收变化的图谱ChlaChlb的吸收光谱有二个强吸收峰640——660nm红光部分叶绿素特有410——470nm蓝紫光部分卟啉环化合物共有（2）荧光和磷光荧光现象：Chl溶液在透射光下呈绿色，而反射光下呈红色的现象。强度大，寿命短（10-9秒）磷光：Chl溶液停止光照后，仍能在一定时间内放出暗红色的光。寿命长（10-2秒——10-3秒）叶绿素的物理、化学性质叶绿素a、b，β-胡萝卜素和叶黄素的紫外-可见吸收光谱图皂化反应Chla、Chlb是双羧酸的酯一个羧基被甲基酯化可发生皂化反应另一个羧基被叶醇基酯化COOCH3C32H30ON4Mg+2KOHCOOC20H39COOKC32H30ON4Mg+CH3OH+C20H39OHCOOK取代反应卟啉环中的Mg2+可被H+、Cu2+、Zn2+取代，被Cu2+、Zn2+取代后仍保持绿色。用酸处理叶片，H+易进入叶绿体，置换镁原子形成去镁叶绿素，使叶片呈褐色。去镁叶绿素易再与铜离子结合，形成铜代叶绿素，颜色比原来更稳定。人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存绿色植物标本。类胡萝卜素(Carotenoids)是一类不饱和的四萜类碳氢化合物，胡萝卜素有三种异构体，即α-、β−和γ−胡萝卜素，其中β−胡萝卜素含量最多，也最为重要。β−胡萝卜素还具有维生素A的生理活性，其结构是由两分子维生素A在端链失去两分子水结合而成。在生物体内，β−胡萝卜素受酶催化氧化即形成维生素A。叶黄素(3，3`-二羟基-α-胡萝卜素，lutein，C40H56O2)是一种常见的氧化型的类胡萝卜素。β−胡萝卜素和叶黄素的结构式如图6-2CH3H3CRCH3CH3CH3CH3CH3RH3CCH3H3Cβ-胡萝卜素（R=H）叶黄素（R=OH）CH2OH维生素A类胡萝卜素吸收光谱都在蓝紫光部分，所吸收的光能传递给叶绿素用于光合作用，保护叶绿素分子不被氧化或阳光破坏。叶绿素a和b、β−胡萝卜素、叶黄素都是难溶于水，易溶于丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等有机溶剂溶剂。根据它们在有机溶剂中的溶解特性，可将它们从植物叶片中提取出来。纸色谱法是分离叶绿体色素最简单的方法，它是以滤纸为惰性支持物，滤纸纤维一般能吸收约20%的水分，其中有6~7%以氢键形式与纤维素上的羟基结合，构成纸色谱的固定相。利用混合色素中各个成分物理、化学性质的差别，在展开过程中，被分离组分在展开剂和固定相之间不断进行分配，并以不同的速度移动，达到相互分离的目的。四、实验器材材料与试剂：菠菜、空心菜等绿色植物、脱脂棉等、固体碳酸钠或碳酸钙、石英砂、丙酮、石油醚、蒸馏水、饱和NaCl水溶液、醋酸铜结晶、NaOH-甲醇溶液等。层析液配方：石油醚20ml+丙酮2ml+苯1ml仪器设备：天平、水浴锅、镊子、玻璃漏斗、分液漏斗、研钵、有塞试管、等等。五、实验方法与步骤1、叶绿体色素的提取（1）将新鲜绿色植物叶片洗净擦干，去叶柄及中脉，称取10g去中脉的叶片，剪碎置研钵内，加入少许固体碳酸钠和10ml乙醇，加少量的石英砂，迅速研磨成匀浆，再加10ml乙醇充分研磨提取叶绿素。（2）在玻璃漏斗底部垫一滤纸，将匀浆过滤到烧杯中，即为色素提取液。放于暗处备用。2、纸色谱法分离叶绿体色素(1)取一张层析滤纸，在中心打一个圆形小孔另取一张5-6cm长，2-3cm宽的小条滤纸，将叶绿体色素粗提液用滴管沿长度方向滴在小滤纸条的一边（色素扩散的宽度限制在0.5cm以内），风干，重复4-5次。风干后沿长度方向卷成纸捻。(2)将纸捻的点样端插入滤纸中心的圆形小孔中，使上端与滤纸平齐。立放于培养皿上,培养皿内装有层析液,纸芯的另一端浸入层析液中。(3)盖上皿盖,静置观察。15min左右色素可充分扩展,分离结束，在滤纸上可得到各种色素的同心圆环。六、叶绿素理化性质的观察(1)光对叶绿素的破坏作用在2支具塞试管中各放入2ml上述色素提取液，盖好塞子。一支试管置暗处，一支试管置强光（如太阳光）下，经2~3h后，取出2支试管观察溶液颜色有无变化，或在分光光度计上测定663nm处吸光度值后进行比较。(2)叶绿素的荧光取2ml上述色素提取液放入一支小试管中，可在窗口与入射光相垂直的方向观察叶绿素暗红色的荧光(3)去镁叶绿素的形成及铜取代作用取1~2ml上述提取液放入试管中，小心加入3ml6mol/LHCl，摇动后静止观察溶液颜色变化？然后向再逐步加入醋酸铜结晶少许，把试管在酒精灯下微微加热，观察溶液的颜色有何变化？（4）黄色素和绿色素的分离：取5ml色素乙醇提取液加到已装有10ml石油醚的分液漏斗中，摇动分液漏斗，并沿分液漏斗的壁小心加入15ml蒸馏水，轻轻转动分液漏斗，加入4~8ml饱和NaCl水溶液，静止几分钟，待分层清楚后，弃去下面的乙醇一水层。再加入15ml蒸馏水，轻轻晃动分液漏斗，以洗去石油醚中残留的乙醇，弃去水层。然后于色素的石油醚溶液中加入5ml30％NaOH甲醇溶液，用力摇动分液漏斗，静止10min，再加蒸馏水8ml，摇动后静置分离，则得到黄色素和绿色色素层，分别保存于试管中。七、注意事项1、叶绿体色素对光、温度、氧气环境、酸碱及其它氧化剂都非常敏感。色素的提取和分析一般都要在避光、低温及无酸碱等干扰的情况下进行。2、使用低沸点易挥发有机溶剂要注意实验室安全。实验室要保持良好的通风条件，不得靠近明火操作。3、提取液不宜长期存放，必要时应避光低温保存。八、讨论研磨叶片提取叶绿体色素时，加入少量碳酸钠有何作用？加多了会出现什么问题？叶绿素溶液为什么会发荧光？黄色素和绿色素分离的原理？实验结果部分1、纸色谱分离色素：要求用铅笔绘制出色素经纸色谱分离后的图形，并用注明各色素环的颜色和名称。2、叶绿素理化性质鉴定：要求写出各个项目的实验现象和并分析其中的原因。见下表叶绿素理化性质鉴定结果实验项目实验现象原因光对叶绿素的破坏作用叶绿素的荧光观察黄色素与绿色素的分离去镁叶绿素的形成及铜的取代反应实验报告格式一、实验名称二、实验目的三、实验原理四、主要仪器设备及耗材五、实验步骤与方法六、实验结果七、思考与练习