含铜多金属复杂矿区的一株浸矿细菌的分离与鉴定

生态环境2008,17(1):[e-mail]基金项目：国家创新研究群体科学基金项目（50621063）；国家973基础研究项目（2004CB619201）作者简介：万民熙（1981－），男，博士研究生，研究方向：微生物学。E-mail:[e-mail]。收稿日期：2007-09-19含铜多金属复杂矿区的一株浸矿细菌的分离与鉴定万民熙1，杨宇1,2*，邱冠周1,2*，钱林1，黄芝英1，夏金兰1,21.中南大学资源加工与生物工程学院,湖南长沙410083;2.生物冶金教育部重点实验室，湖南长沙410083摘要：为寻找新的浸矿细菌，从江西城门山矿区硫化矿矿坑水中使用平板分离法得到了一株能够浸矿的细菌，命名为CMS。经电镜和生理生化试验，鉴定该菌株为革兰氏阴性细菌，短杆状，菌体大小为（0.4±0.1）μm×（1.4±0.5）μm,最适生长温度为25~30℃，最适pH值为2.0，化能自养型，能利用亚铁、单质硫和葡萄糖生长，不能利用硫代硫酸钠、蛋白胨生长。16SrRNA系统发育树的结果表明，CMS菌株与嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillusferrooxidans，简称A.f）AFY菌株位于系统发育树一个同的分支中,相似度99.72%。克隆其代谢系统关键基因亚铁氧化酶（Iroprotein）基因并测定其序列，与其他相关菌株比对，结果显示编码区的核酸序列与报道序列完全一致。另外，其铁闪锌矿(ZnFe)S摇瓶浸出试验显示，在浸出28d后，含菌株的摇瓶的锌离子质量浓度即达到615.50mg·L-1，而无菌浸出仅有392.25mg·L-1。关键词：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；生物浸出；亚铁氧化酶基因；16SrRNA序列；中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1672-2175（2008）01-0122-06生物冶金是利用以矿物为营养基质的微生物，将矿物氧化分解从而使金属离子进入溶液，通过进一步分离、富集、纯化而提取金属的高新技术。目前生物冶金的研究对象已经扩大到利用具有浸矿能力的细菌进行铜、铀、金、锰、铅、镍、铬、钴、铁、砷、锌、铝等几乎所有硫化矿的浸出[1-2]。由于生物冶金技术特别适于处理贫矿、废矿、表外矿及难采、难选、难冶矿的堆浸和就地浸出，并具有过程简单、成本底、能耗低、对环境污染小等突出优点，正在工业生产中逐步推广应用[3]。本文研究的城门山铜矿是国内建设条件较好的一个大型铜硫矿山，由于矿石性质复杂，传统方法较难再提高选矿技术指标，适用生物冶金进行选矿[4]。目前嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillusferrooxidans，简称A.f菌）是一种最重要的、已被广泛研究和应用的生物浸出细菌,在微生物浸矿体系具有非常重要的生态地位[5]。A.f菌属微生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。主要代谢特点：碳源为CO2，氮源为NH4+，以氧化Fe2+、S0及S2－的化合物等来获得所需能量[6-7]。自从1947年由Colmer和Hinkle首先分离纯化并命名以来,一直是在生物浸出及其他如煤脱硫方面最主要的细菌之一,受到国内外研究者的重视和研究[3,8-9]。但国内外的研究均表明,来源不同的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株对金属硫化矿物的浸出效果是不同的[6,8]。因此采集不同样点的水样，以筛选出适应于不同底物作用的优良菌株，对不同矿物的生物浸出、了解不同地域和环境下A.f菌的多样性（包括种群多样性、系统发育多样性和功能多样性）和生态演化规律，进一步解析冶金微生物的群落结构和功能的有重要意义以及开发高效浸矿菌株有重要意义[10-11]。本文即从江西城门山矿区硫化矿矿坑水中，分离纯化了一株铁硫氧化细菌，进一步的生理生化显示为嗜酸氧化亚铁硫杆菌，同时考察其对铁闪锌矿的浸矿能力，证实它具有浸出铁闪锌矿的能力。1材料和方法1.1菌种分离菌株由江西城门山矿区的矿坑水中分离得到,故命名为CMS。矿区中矿石为已受不同程度氧化的含铜多金属复杂矿，主要矿物有：黄铁矿、黄铜矿、菱铁矿、磁铁矿、闪锌矿等[4]。矿坑水温度为25℃左右，pH值为6.6，呈弱酸性。将采集到的酸性水样先用9K液体培养基[12]富集培养，待培养基的pH下降到1.0左右，用梯度稀释法在改进的9K固体培养基涂布[13]，再用平板划线法分离。1.2培养基采用的培养基－液体培养基（9K），配方如下：(NH4)2SO43g·L-1,KCl0.1g·L-1,K2HPO40.5g·L-1,MgSO4·7H2O0.5g·L-1,Ca(NO3)20.01g·L-1，FeSO4·7H2O44.7g·L-1,pH值1.8～2.0。分离培养基为改进的9K固体培养基，即在每升9K液体培养基中加入琼脂15g，KSCN15.4g,pH值2.0～2.2。基础培养基为不加FeSO4的9K培万民熙等：含铜多金属复杂矿区的一株浸矿细菌的分离与鉴定123养基。1.3生理生化特性最适温度：CMS菌株都以相同的菌量接种到9K液体培养基中，分别致于不同的温度的条件下，培养3d，用血球计数板计数，测定不同温度下CMS的生长状况。最适初始pH值：用1mol·L-1的硫酸将9K液体培养基调至不同pH值，接种相同的菌量，培养3d，用血球计数板计数，测定不同pH条件下菌的生长状况。能量利用特性：基础培养基（不加Fe2+的9K培养基）中分别加入蛋白胨（质量分数:0.1%）；葡萄糖（质量分数:0.1%）；硫磺（质量分数:5%）；硫代硫酸钠（质量分数:1%）；七水合硫酸亚铁（质量分数:14.7%）；七水合硫酸亚铁（质量分数:14.7%）+蛋白胨（质量分数:0.1%）；七水合硫酸亚铁（质量分数:14.7%）+葡萄糖（质量分数:0.1%）。其中硫代硫酸钠、七水合硫酸亚铁（质量分数:14.7%）过滤除菌后加入培养基，硫磺隔水蒸煮1h灭菌，再加入培养基。以CMS菌株悬液接种，每培养3d传代一次。连续传代3次，涂片并在显微镜下观察菌的生长情况。1.4电镜观察30℃液体培养细菌至对数生长期，收集菌体，经革兰氏染色后在光学显微镜下观察。将菌体涂布在小块盖玻片上，自然晾干后，再用导电胶贴于圆形贴片上，喷金后在扫描电镜下观察。1.5亚铁和硫氧化活性的测定亚铁氧化活性测定：取CMS菌株的液体培养物，用5×10-4mol·L-1的K2Cr2O7对其中的Fe2+进行滴定。每隔一段时间（一般为3～4h）取0.5mL菌液，用蒸馏水（或者体积分数为1％的稀硫酸）稀释10倍，再取其中的1mL滴定，每次进行3次重复，然后取其平均值作为滴定值。滴定用1:1的硫磷酸作为络合剂，用质量分数为0.2％的二苯胺磺酸钠作指示剂，滴定至亮紫色即到滴定终点。硫氧化活性测定：将CMS菌株接种到只添加了单质硫的基础培养基(硫质量分数:5%)中，通过pH值的变化来考察CMS菌株的硫氧化活性。1.6浸矿试验矿样为铁闪锌矿，粒度分布为104~147μm。选用基础培养基（不加Fe2+的9K培养基）初始pH为2.0，接种量为10%，调节初始菌量为1.0×107个·mL-1，浸矿条件：矿样量5%(g·L-1)，160r·min-1，30℃，空白对照除不接菌种，其他浸矿条件相同。1.7基因组提取和PCR扩增对纯化后培养的菌株使用Sangon公司的UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA。1.7.116srDNA扩增体系（50μL）：33μL无菌水、10×PCRbuffer5μL、10×dNTPs5μL、引物FC27和RC1492各2μL（5pmol·μL-1）、TaqDNA聚合酶1μL、CMS菌株的基因组DNA2μL。扩增程序：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃3min（共30个循环）；72℃10min。PCR引物为通用引物[3]如下：正向引物（FC27）：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物（RC1492）：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。1.7.2亚铁酶氧化酶基因扩增体系（50μL）：33μL无菌水、10×PCRbuffer5μL、10×dNTPs5μL、引物YT1和YT2各2μL（5ppmol·μL-1）、TaqDNA聚合酶1μL、CMS菌株的基因组DNA2μL。扩增程序：94℃2min；94℃40s，59℃30s，72℃40s（共35个循环）；72℃5min。引物设计参考NCBI中标准序列（索引号：EO3451,大小500bp）,利用Primer5在线设计，引物序列[14]如下：正向引物（YT1）：5’-CTCTGACCGGCGAATCGGG-3’，反向引物（YT2）：5’-CCAACCGCATCCGCATATCTTG-3’。1.8基因测序及分析采用克隆测序技术。克隆试剂盒为上海生工的PCR产物克隆试剂盒SK2212。载体选用pUCm-T，蓝白筛选后所得的重组克隆交由北京三博远志生物技术有限责任公司测序。16srDNA序列已经提交到GenBank(登录号：DQ062118)，并将该16srDNA序列与GenBank核酸序列数据库进行序列比较，用clustalx1.8软件进行全序列比对[15]，并构建系统发育树。亚铁氧化酶基因序列已经提交到GenBank(登录号：AY864810)，并将该序列与GenBank核酸序列数据库进行序列比对。2结果与讨论2.1菌株形态与生理生化特性经过革兰氏染色鉴定，该菌株为革兰氏阴性细菌，短杆状，菌体大小为（0.4±0.1）μm×（1.4±0.5）μm。在改进的9K固体培养基，菌落表面干燥，呈圆形,直径约为0.6～1.0mm，边缘不规则，中央呈浅褐色（如图1所示）。最适生长温度为25~30℃，最适pH值为2.0。利用亚铁、单质硫和葡萄糖生长，不能利用蛋白胨生长，且在亚铁葡萄糖混合培养基和亚铁蛋白胨混合培养基中也能生长(如表1所124生态环境第17卷第1期（2008年1月）示)。考察葡萄糖和蛋白胨对CMS菌株生长的影响，适当加大了硫酸亚铁+葡萄糖混合培养基中葡萄糖的含量，菌生长量减少，表明葡萄糖、蛋白胨对CMS菌株的生长有抑制作用。图2为在温度30℃，pH值1.8的9K液体培养基中，CMS菌株的生长曲线。2.2亚铁氧化活性和硫氧化活性2.2.1亚铁氧化活性亚铁氧化活性实验表明：CMS菌株有较强的亚铁氧化活性，且亚铁氧化活性的强弱与菌的生长相关。7h时，亚铁氧化率较低，和空白对照无明显差别，这是细菌被转移到新的环境后的一个适应过程,生长繁殖处于诱导期；在7h到35h之间，菌开始进入缓慢生长期。随着培养时间的增加，亚铁氧化率慢慢提高，与空白对照有很大差异；在35h时进入了对数生长期，亚铁氧化率也急剧增高；在47h以后，亚铁氧化率达到99.2%。结合生长曲线和亚铁氧化率曲线图，说明CMS菌株的亚铁氧化活性与菌的生长密切相关，菌的生长越快，亚铁氧化活性越强。虽然CMS菌株为化能自养菌利用Fe2+为能源生长,但与一般微生物所具有的生长规律一致[16]。图3为CMS菌株在最温度为30℃，pH值为2.0的9K培养基中的亚铁氧化率曲线图，CMS曲线是接种了CMS菌株的培养基中Fe2+氧化随时间变化曲线。Control曲线为空白对照。2.2.2硫氧化活性接种后9d内，pH值持续下降，且下降速度越来越快；第9天后，pH值变化维持一个比较稳定的速度，由此推测菌已处于对数生长期中；18～21d间，pH变化趋于平缓，此时菌已处于平稳期中。图1CMS菌株的菌落形态和透射电镜Fig.1ThecolonyofCMSandscanningelectronmicrograph0102030405060020406080100120N/(106.ml-1)t/h图2CMS菌株生长曲线Fig.2ThegrowthgraphofCMSstrain表1CMS菌株能源利用特性Table1CharacteristicsofCMSstr