吸入异氟烷对大鼠肺表面活性蛋白-A(SP-A)的影响

吸入异氟烷对大鼠肺表面活性蛋白-A（SP-A）的影响李志红1杨拔贤2安海燕2（1北京肿瘤医院麻醉科，北京，100036；2北京大学人民医院麻醉科，北京，100044）摘要目的观察大鼠吸入不同浓度异氟烷时，肺表面活性蛋白-A(SP-A)的含量及其基因表达的改变。方法雄性Wistar大鼠104只随机分为5组：组1，空白对照组（Con，n=8）；组2，40%O2对照组（40%O2，n=24）；组3，0.7%异氟烷组（0.7%Iso，n=24）；组4，1.5%异氟烷组（1.5%Iso，n=24）；组5，2.0%异氟烷组（2.0%Iso，n=24）。其中组2吸入40%O2，组3、4、5大鼠分别吸入设定浓度的异氟烷（载气为40%O2）。除空白对照外，其余各组再分为三个亚组：4小时组（4hr，n=8）、8小时组（8hr，n=8）和10小时组（10hr，n=8）。4hr和8hr亚组分别吸入各组气体4小时和8小时，组2中10hr亚组吸入40%O210小时，3、4、5组中10hr亚组分别吸入设定浓度异氟烷8小时，停药后再吸入40%O2两小时。于设定时间点迅速处死实验大鼠，取肺组织透射电镜观察肺泡Ⅱ型上皮细胞结构变化；检测支气管肺泡灌洗液中SP-A的含量（WesternBlot）；Ⅱ型上皮细胞中SP-A的含量（IHC）；以及SP-AmRNA的表达（RT-PCR）。结果1．40%O2组中各亚组的各项指标与Con组均无显著差异。2．透射电镜观察肺泡Ⅱ型上皮细胞结构：吸入异氟烷后，0.7%Iso组肺泡Ⅱ型上皮细胞形态学无明显改变；1.5%Iso组和2.0%Iso组的肺泡Ⅱ型上皮细胞可见明显形态学改变，尤以8hr亚组明显。3．支气管肺泡灌洗液（BALF）中SP-A的含量：0.7%Iso组中4hr亚组外，各吸入异氟烷组大鼠的BALF中SP-A的含量均较Con组显著下降(p0.01)；1.5%Iso组和2.0%Iso组中8hr亚组较0.7%Iso组8hr亚组下降更明显（p0.01）。各组内不同亚组间的比较可见：0.7%Iso组中8hr、10hr亚组较Con组明显下降（p0.01），但两亚组间无明显差别；1.5%Iso组与2.0%Iso组中各亚组均明显低于Con组（p0.01），各亚组间也未见明显区别。4．免疫组化检测肺Ⅱ型上皮细胞中SP-A的含量：1.5%Iso组与2.0%Iso组肺泡Ⅱ型上皮细胞中SP-A的含量明显下降，而0.7%Iso组较Con组无明显变化。5．肺组织匀浆中的SP-AmRNA含量：吸入异氟烷的各组中，0.7%Iso组SP-AmRNA的含量与Con组、40%O2组均无明显差异；1.5%Iso与2.0%Iso组中4hr、8hr亚组SP-AmRNA的表达均明显低于Con组、40%O2组和0.7%Iso组中相应的亚组，有统计学差异（p0.01），各组的10hr亚组均恢复至Con组水平。结论吸入1.5%或更高浓度的异氟烷4小时以上，可降低大鼠肺组织SP-A的基因表达和蛋白合成，并可能影响其分泌和再摄取。停止吸入异氟烷2小时后，大鼠肺组织SP-A的基因表达可恢复至正常水平，但蛋白合成需更长时间才能恢复。［关键词］异氟烷；肺表面活性蛋白-A（SP-A）；基因表达异氟烷（isoflurane，Iso）由于具有安全、低毒和可控性好等优点，而成为目前临床最常用的吸入麻醉药。但是，其对呼吸系统，尤其是对肺泡上皮细胞的不良影响也已为人们所重视。有动物实验表明，异氟烷可以降低肺表面活性物质(pulmonarysurfactant,PS)的合成（包括磷脂和蛋白），增加肺部的炎性反应并降低肺部的防御机制，［1-5］是引起术后肺部并发症(如肺不张、肺部感染等)的影响因素之一。而肺表面活性蛋白-A（surfactantproteinA,SP-A）是肺表面活性物质中含量最多，与PS的合成和分泌密切相关的一种蛋白质，并对PS的生理功能和肺自我防御机制起到重要作用［6-7］。有研究表明，大鼠吸入较高浓度异氟烷时，支气管肺泡灌洗液中的SP-A浓度下降。［8］异氟烷还可使培养的正常Ⅱ型肺泡上皮细胞内和培养液中SP-A的含量降低。［5］然而，吸入异氟烷引起上述改变发生在哪一水平，目前还未见明确报道。因此，本实验研究拟通过检测吸入不同浓度异氟烷大鼠的支气管肺泡灌洗液(broncho-alveolarlavagefluid,BALF)和肺组织中SP-A的含量，以及肺组织中SP-AmRNA含量的变化，来探讨异氟烷对肺内SP-A的合成、分泌与基因表达的影响。材料与方法(一)实验动物:健康成年Wistar大鼠104只，体重200±10g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，于北京大学人民医院实验动物中心（SPF级）预检7-10天，六只一笼饲养，动物室和实验室温度为23oC，12h明暗轮流光照，自由饮食。(二)试剂与药品:异氟烷（美国雅培制药有限公司）戊巴比妥钠（德国默克制药公司）40%Acrylamide（丙烯酰胺:N,N’－双丙烯酰胺=29:1，美国Bio-Rad公司）；N，N，N’，N’－四甲基乙二胺（TEMED，美国Promega公司）；标准分子量蛋白（ProteinMolecularMarkers，美国Biolab公司）；标准浓度蛋白（美国Promega公司）；蛋白分析液（美国Bio-Rad公司）；Tween-20（美国Bio-Rad公司）；苯甲磺酰氟（PMSF，美国Sigma公司）；正钒酸钠（SodiumOrthovanadate，NaVO4，美国Sigma公司）；抑肽酶（Aprotinin，美国Sigma公司）；ECL化学发光试剂盒（英国Amersham公司）；兔抗SP-A多克隆抗体（美国SantaCruz公司，工作浓度1:200）辣根过氧化物酶结合羊抗兔多克隆抗体（美国SantaCruz公司，工作浓度1:2000）；LSAB试剂盒（丹麦Dako公司）；RNA提取试剂（Trizol，美国Promega公司）；TBE5×（上海生工生物工程技术服务有限公司）；Oligo(dT)15、M-MLV逆转录酶（美国Promega公司）；Rnasin（日本Toyobo公司）；焦磷酸二乙酯（DEPC，美国Sigma公司）；2×TaqPCRMasterMix（包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2，浓度为2×）（北京天为时代公司）；核酸分子量参照物：DNAmarkerⅡ（北京天为时代生物科技有限公司）；琼脂糖（购自北京鼎国生物有限公司）；(三)主要仪器:Narcomed2B麻醉机（Drager公司）机玻璃麻醉箱（40cm×30cm×30cm）（北京有机玻璃厂）气体监测仪（Datex-Ohmeda，芬兰）低温高速离心机（Sigma公司、Eeppendoff公司）恒温水浴锅（哈尔滨东方电控开关厂）VM-1000型涡旋振荡器（UpwardsBiosystems公司）10kD离心超滤管（美国Millipore公司）MiniIIPROTEAN稳压稳流型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；石墨转移电泳仪（北京科普仪器厂）；紫外/可见分光光度计（日本SHIMADZU公司）；-80℃低温冰箱（日本SANYO公司）；TN型托盘式扭力天平（上海第天平仪器厂）；AEU-20电子天平（德国Siemens公司）；300℃烤箱（天津市实验仪器厂）；DT-100光电天平（北京光学仪器厂）；台式高速离心机（上海医用分析仪器厂）；HybondPVDF膜（美国Amersham公司）MOS-1水平摇床（北京Beide公司）；X光胶片（美国Kodak公司）；组织切片机（德国Leitz公司）；双目显微镜（日本Olympus公司）；PCR仪（德国Eppendorf公司）(四)实验方法:1．实验动物分组：雄性Wister大鼠104只随机分为5组：组1，空白对照组（Con，n=8）；组2，40%O2对照组（40%O2，n=24）；组3，0.7%异氟烷组（0.7%Iso，n=24）；组4，1.5%异氟烷组（1.5%Iso，n=24）；组5，2.0%异氟烷组（2.0%Iso，n=24）。除空白对照外，其余各组再分为三个亚组：4小时组（4hr，n=8）、8小时组（8hr，n=8）和10小时组（10hr，n=8）。4hr和8hr亚组分别吸入各组气体4小时和8小时，组2中10hr亚组吸入40%O210小时，3、4、5组中10hr亚组分别吸入设定浓度异氟烷8小时，停药后再吸入40%O2两小时。2.检测指标和方法2.1肺组织的取材和固定实验结束后取出试验大鼠，麻醉（1g/L戊巴比妥钠，40mg/kg，）后，采用14号套管针外套管行气管插管，放血活杀。从每只大鼠右上肺叶切取约2mm3肺组织，3%戊二醛固定。超薄切片，透射电镜观察。其余右上肺叶，4%甲醛固定，石蜡包埋、切片。另外3叶右肺组织-70℃冻存备用。2.2检测BALF中SP-A的浓度（WesternBlotting）按照参考文献［9-10］的方法收集肺泡灌洗液。大鼠放血活杀后，于肺门处结扎右主支气管，自气管插管缓慢向左侧肺内注入生理盐水（4℃预冷）12ml/kg，注毕，使液体在肺内停留30秒，然后放平注射器，抬高大鼠下半身，借重力收集肺泡内灌洗液体，重复3次。将3次所得灌洗液收集汇总，记录总量，计算灌洗回收率，总回收率为80%左右。将BALF于4℃、1000rpm离心10min，去除细胞和杂质。上清液经超滤（超滤管Millipore，USA）浓缩约10～15倍。Follin酚法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，配制样品的终浓度为1μg/μl，按每泳道40μl样品上样，10%聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳（Biorad，USA）。WesternBloting法对SP-A进行免疫印记分析，一抗为兔抗SP-A多克隆抗体（SantaCruz，USA），辣根过氧化物酶标记二抗，化学发光（二抗与发光液，SantaCruz，USA），曝光X光片，将X光片上的条带数字化，并进行统计分析。2.3检测肺泡Ⅱ型上皮细胞中的SP-A含量（immunohistochemistry，IHC）取右上肺组织石蜡切片，经脱蜡、H2O2封闭。采用兔抗SP-A多克隆抗体（SantaCruz，USA）4℃过夜。二抗及显色系统应用免疫组化试剂盒（中杉公司），DAB显色后于光镜下观察，结果以胞浆内可见棕红色颗粒者为阳性，并按下列标准判断：(-)为不着色或呈背景颜色；(+)为弱阳性，细小显色颗粒，数量稀少；(+++)为强阳性，粗大显色颗粒，数多密集；(++)为表现介于(+)和(+++)之间。［11］2.4肺组织内SP-AmRNA含量（RT-PCR）取-70℃冻存的肺组织50μg，总RNA提取用酸酚一步法(试剂为Trizol,Invitrogen，USA)。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)（逆转录酶M-MLV，Promega，USA；Taq酶2×buffer，Tiangen，北京）方法测定SP-AmRNA相对含量。GAPDH作为内参照。PCR产物经2%琼脂糖凝胶（含EB）电泳，于紫外灯下可见清晰条带，扫描并行图象和分析。引物序列［12-14］：SP-A上游5’-atgtcactgtgttctttggccttc-3’下游5’-tcaaaattcacaaacagccagcc-3’；GAPDH上游5’-gggcagcccagaacatcatcc-3’下游5’-ccagccccagcatcaaaggtg-3’。SP-A、GAPDH扩增产物为747bp、298bp。(五)统计方法:实验数据以SPSS13.0软件包处理，以均数标准差(xs)表示。计量资料采用单因素方差分析和LSD法两两比较，P0.05为差异有统计学意义。结果1．40%O2组中各亚组的各项指标与Con组均无显著差异。2．形态学观察(表1)：对照组可见正常肺泡结构正常，电镜下见肺泡Ⅱ型上皮细胞附于肺泡壁，细胞器清晰，肺泡腔侧见大量板层体，板层体出胞现象多见。0.7%Iso组在光镜和电镜下均与对照组差异不大，但板层体出胞现象较少见。1.5%Iso组与