副溶血弧菌噬菌体用于生物防治的初步研究

副溶血弧菌噬菌体用于生物防治的初步研究蔺红苹1邱德全2谭龙艳2（1湛江师范学院生命科学与技术学院广东湛江524048）（2广东海洋大学广东湛江524025）摘要：用浓度分别为1106、1105、1104pfu/mL的噬菌体进行生物防治实验，结果表明施加噬菌体的实验组对虾的死亡率明显比对照组低，且实验组对虾发病情况较轻。同时使水体中氨氮和亚硝酸盐含量等有不同程度的下降。凡纳滨对虾各组织器官含菌量实验表明，噬菌体对水体中弧菌的祛除可直接影响到对虾体内的含菌量，而噬菌体在清除水体中副溶血弧菌的同时对对虾体内的副溶血弧菌也有一定的清除作用。这对水产经济动物副溶血弧菌病的防治起着积极的作用。对对虾血淋巴中血细胞浓度测定发现，噬菌体的加入能使对虾血细胞含量保持相对稳定。关键词：副溶血弧菌，噬菌体，生物防治中国分类号：Q93文献标识码：文章编号：随着水产养殖结构的调整及WTO的加入，水产养殖必须走可持续发展的道路，实施健康养殖，使养殖的产品成为绿色食品。有益微生物在这方面大有用武之地。噬菌体是一种细菌病毒，它寄生和裂解细菌的生物学特性引起了人们极大的兴趣和关注。笔者研究了副溶血弧菌噬菌体对水体中和养殖对虾体内副溶血弧菌的消除及对养殖水生态环境的改善，旨在进一步探索噬菌体在防治鱼类细菌性疾病方面的应用效果，开拓鱼虾病生物防治的新途径，为养殖生产提供基础资料。1材料1.1宿主菌株：本实验室分离、鉴定[1-2]的副溶血弧菌菌株。1.2实验用虾：取自湛江市东海岛奄里村虾塘。2.实验方法2.1凡纳滨对虾攻毒实验根据文献[3-,5]的方法，略加改动。取平均体长约10cm的健康凡纳滨对虾，放养于水箱内，水100l，海水盐度18，虾48尾，室温。将试验分为1~5组，菌收稿日期：作者：蔺红苹（1979—），女，硕士，主要研究方向为水产经济动物病害及微生物学研究通讯作者：蔺红苹（1979—），女，硕士，主要研究方向为水产经济动物病害及微生物学研究Tell13543544676,Email:[e-mail]液浓度分别为1.0×108；2.0×107；4.0×106；8.0×105；1.6×105cfu/ml；及不加菌的对照组，每天观察各组对虾的情况，并取4d后的各组对虾的血淋巴测定血细胞数目和各组织器官，检测含菌量。2.2养殖条件下副溶血弧菌噬菌体对宿主的去除及对养殖生态环境的改善根据文献的方法[6-11]，进行噬菌体防治鱼类细菌性疾病的室内试验：时间为2004年7月、8月、9月、10月。试验用水箱共10只，其中6只为试验箱，4只为对照箱。每水箱加盐度为18的海水100l，凡纳滨对虾48尾。按时、定量投料，每天吸污。副溶血弧菌感染途径为浸泡感染：在室温下，用液体培养基将副溶血弧菌培养8h，然后将菌液离心，用灭菌海水洗涤，加入1、2、3和对照I组水箱，使箱内水体含菌量达1.0×108个/ml。对照II组不做任何处理。三组试验箱内分别加噬菌体1.0×106pfu/ml（1组）、1.0×105pfu/ml（2组）、1.0×104pfu/ml（3组），对照组不加噬菌体。每一浓度做两个平行，结果取两个平行的平均值。使用噬菌体后，每天观察各组对虾的情况；定时测定试验箱中水的pH、氨氮、COD、弧菌总数及副溶血弧菌数、细菌总数及噬菌体数，一天测一次，实验周期为一周，重复实验三次。细菌数量用胰蛋白胨琼脂平板记数法；弧菌记数用TCBS琼脂平板；噬菌体数量用双平板法；pH值测定用pH计；COD测定采用碱性高锰酸钾法；氨氮用奈氏试剂法；亚硝酸盐采用重氮—偶氮比色法[12]。血球记数板记数各实验组的血细胞含量及取各实验组对虾的肝胰脏、鳃、肠，测定其中的含菌量。3结果3.1凡纳滨对虾攻毒结果表1成虾攻毒实验结果实验用虾尾数菌浓度（pfu/ml）死亡数死亡率（%）发病数症状1481×1082041.716附肢发红和，不动，或沿水箱壁漫游，所有病虾均空胃，肝胰腺肿大，不摄食。2482×10748.316附肢发红，病症较轻3484×1060012附肢发红，病症较轻4488×105000未见明显变化5481.6×105000未见明显变化对照480000未见变化将试验四天后对虾用灭菌生理盐水冲洗，然后分离各部位，在灭菌匀浆器中加2ml灭菌生理盐水匀浆，再适当稀释后涂平板记数弧菌数量。并将各实验组的剩余对虾用灭菌注射器吸取血淋巴，用抗凝剂抗凝，然后用细胞记数板记数各实验组的血细胞含量。表2凡纳滨对虾各器官、组织的含弧菌量（cfu/g）及血细胞浓度（个/ml）肝胰腺肠鳃血细胞数12.1×1052.8×1071.1×1062.02×10625.6×1043.5×1059.2×1052.89×10633.8×1041.9×1055.3×1053.22×10643.6×1031.9×1041.7×1053.28×10652.9×1031.7×1042.5×1043.42×106对照2.8×1031.5×1046.0×1034.11×106由表2可看出，各实验组凡纳滨对虾的各部分的含弧菌量远比对照组多，特别是表现在肝胰脏和肠内菌量上，肝胰腺和肠内弧菌量大，是导致对虾患病的原因。随着水体中含菌量的加大，对虾的血细胞数目呈下降趋势，说明该副溶血弧菌具有溶血毒性。由于1.0×108cfu/ml量的副溶血弧菌能让对虾出现明显的病症，所以在以下的实验中，用1.0×108cfu/ml的菌量。3.2养殖条件下副溶血弧菌噬菌体对细菌的去除及对养殖生态环境的改善3.2.1凡纳滨对虾实验情况表3噬菌体防治副溶血弧菌病的试验组别试验虾数（尾）菌量(cfu/ml)噬菌体添加量（pfu/ml）存活数（尾）存活率（%）死亡率（%）备注1481×1081×1064492848h后偶有轻微病症出现2481×1081×105408317同上3481×1081×10432673348h发病对照I481×108020425824h发病，并陆续死亡对照II4800481000对虾生长良好由表3可看出，施加噬菌体的试验组，对虾死亡率明显比对照组低，且试验组发病对虾症状较轻，噬菌体使用浓度越高，对虾的发病程度就越轻，存活率就越高。3.2.2副溶血弧菌噬菌体对对细菌数量和水质的影响表4各组实验结果时间（d）123对照1对照2细菌总数03×1082.8×1082.9×1082.8×1081.8×106(cfu/ml)12.6×1082×1087×1083.5×1082×10628×1078.5×1074.6×1084.6×1081.5×10635×1075×1071.5×1085.2×1083×10641.5×1066×1063×1077×1084.2×10654×1052×1061×1071×1088×10665.2×1051.8×1061.2×1079×1075.1×10673.8×1059×1055×1067.5×1072.2×106弧菌总数01.4×1081.25×1081.3×1081.28×1083×105(cfu/ml)18×1077.1×1076×1082.8×1083.4×10523.4×1072×1072×1083.58×1084.7×10531×1069×1068×1075×1085.2×10547×1051×1061.5×1073×1083.7×10553.9×1055×1057×1068×1072.4×10564.2×1045.2×1048.2×1066×1072.4×10571.1×1033×1041.2×1067×1071.5×105噬菌体数01.2×1063×1051.2×10400(pfu/ml)18.8×1063.2×1053.8×1040021×1071×1061.1×1050034.9×1071.6×1064×1050042×1078×1062×1060051.5×1079.4×1067×1050062.8×1065×1053×1040074×1058×1045×10300pH07.87.87.87.87.817.67.67.87.77.827.67.77.67.57.837.67.67.67.57.947.77.77.47.47.957.57.57.77.37.667.57.67.57.37.777.57.67.57.37.6COD(mg/L)018.9218.6019.0418.3218.48121.822.8411.5621.7218.00216.418.0010.2421.5616.12316.9218.6819.2219.8016.20417.217.9218.6420.8817.12516.8817.2818.3220.1617.35616.4116.8817.5220.4417.41氨氮00.450.440.470.460.4810.720.740.720.730.4920.700.720.710.740.5230.650.680.700.760.5840.520.610.680.780.6450.480.560.620.800.6760.440.520.580.820.66亚硝酸盐00.0730.0760.0810.0740.072(mg/l)10.0590.0640.0720.1020.08320.1070.1190.1280.1900.13430.1820.1650.1950.2110.18440.2600.2140.2420.2610.22950.3140.2690.2860.3170.27060.3470.3060.3280.3500.303细菌总数：方差分析表明，三个实验组和对照I组之间F=4.493，P=0.0140.05，差异显著。SNK法多重比较显示，1、2实验组之间细菌总数在5%水平上差异不显著。1、2和对照I组在5%水平上差异显著，第3组和对照I组差异不显著。弧菌数：方差分析表明，3个组之间弧菌数量F=4.397，P=0.0150.05，差异显著。SNK法多重比较显示，1、2实验组之间弧菌总数在5%水平上差异不显著。1、2和对照I组在5%水平上差异显著，第3组和对照I组差异不显著。COD：F=2.987，P=0.0590.05，差异不显著。氨氮：F=7.076，P=0.0020.01，差异极显著，三个实验组5%水平上差异不显著，都和对照I组差异显著。亚硝酸盐：F=8.190，P=0.0010.01，差异极显著，三个处理组之间不显著，都和对照I组差异显著。细菌总数和副溶血弧菌菌群数：由结果可看出，噬菌体对池塘水体中的细菌和弧菌菌群都有明显的清除作用。这一结果还表明，水体中噬菌体浓度越高，数量越多，对细菌和弧菌的清除作用就越强。噬菌体数量：由表可知，当噬菌体开始清除细菌时，其本身得到增殖，当弧菌减少时，噬菌体的数量反而减少。这充分说明，噬菌体与宿主菌本身有很大关系[13-14]。pH值、氨氮、COD、亚硝酸盐：由方差分析可知，噬菌体对水质可产生不同程度的有利影响。三个实验组氨氮的测定值明显比对照I组低，也比对照II组低，去除率达19.4~38.9%；亚硝酸盐含量也明显降低。3.2.3凡纳滨对虾各组织、器官中弧菌含量如下表：表5对虾各组织器官的弧菌含量（cfu/g）时间（d）1组2组3组对照1对照2鳃13.06×1054.5×1056.3×1063×1063×10425.8×1055.9×1061.9×1062.8×1068.1×10434.6×1041.4×1042.4×1047.7×1067.7×10343.8×1062×1051.2×1053.6×1072.2×10552.11×1052.7×1051.14×1058.2×1064.8×10462.7×1052.8×1053.3×1051.2×1074.3×105肝胰脏18.94×1054.1×1052.6×1054×1052×10329.1×1047.9×1052.6×1052.1×1058.5×10335.2×1049.9×1052.5×1052.3×1056