加洲鲈鱼诺卡氏菌病的初步研究

1池塘养殖加州鲈鱼诺卡氏菌病的初步研究杨治国1，郭国强2,王振华1(1信阳农业高等专科学校，河南信阳464000)(2洛阳师范学院，河南洛阳471022)摘要：首次报告中国大陆地区加州鲈鱼诺卡氏菌病的发生情况。病鱼体表出血、溃烂，肌肉、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、生殖腺、肠系膜等布满大量直径1-20mm的黄白色结节。从病鱼内脏组织的结节中分离培养出短杆状或细长杆状有分枝的革兰氏阳性、弱抗酸菌体。用分离菌株作回归感染，证实分离菌为加州鲈鱼的病原菌。对病原菌的基本生物学特性进行了研究，确定病原为诺卡氏菌(Nocardiasp.)。关键词：加州鲈鱼；诺卡氏菌病；池塘养殖中图分类号：965.322文献标识码：A文章编号：Preliminarystudyonnocardiosisinpond-culturedlarge-mouthblackbass，MicropterussalmonoidesYangZhi-guo1，GuoGuo-qiang2，WangZhen-hua1(1XinyangAgriculturalCollege，Xinyang，Henan464000)(2LuoyangNormalUniversity，Luoyang，Henan471022)Abstract:InOctober2006，Asimilarbacterialtuberculosisbrokeoutinpond-culturedlarge-mouthblackbass(Micropterussalmonoides)inShunde，GuangdongProvince，ChinaMain．ThediseasesubsequentlybrokeoutfromSeptembertoOctober2009,inpond-culturedlarge-mouthblackbassinNanyanginHenanProvince.Here,theaffectedfishbodyweightwere450to600g.Multipleyellowishwhitenodules(granulomas),varyinginsizefrom1to20mmindiameter,arescatteredthroughoutthemuscle,heart,liver,spleen,ovary,andmesenteries.Purebacteriawereisolatedfromliverandkidneyindiseasedfish,useofLowenstein-Jensenmedium.Experimentalinfectionindicatedthattheisolatedbacteriumwasthepathogenresponsibleforthemortalities.Basedonthegrowthcharacteristics，morphological，physiological，andbiologicalpropertiesofthebacterium，theisolatedwereidentifiedasNocardiasp.．Keywords：Micropterussalmonoides;Nocardiosis;pond-culture加州鲈鱼学名大口黑鲈(Micropterussalmonoides)，为北美洲太阳鱼科鱼类，自上世纪80年代引进中国大陆后，发展很快，现已成为淡水名特优养殖品种之一。2006年10月，河南省信阳市某酒店从市场购进一批加州鲈鱼，加工过程中发现鱼肌肉中有许多5-10mm的白色坏死结节，涂片检查发现，坏死结节中有大量革兰氏阳性、杆状、丝状、有分支的菌体，初步判断为细菌性结节症。追踪调查显示，该批鱼来自广东省顺德池塘养殖，因此，我们就没有做进一步的研究。2009年9-10月，河南省南阳市鸭河口水库霍姓养殖户池塘饲养的加州鲈鱼发生连续死亡，病鱼类似2006年所见加州鲈鱼，体表出血、溃疡，严重者出现瘘管致死；病鱼内脏、肌肉中有许多黄白色结节，二个月累积死亡率约12%。霍姓养殖户自述2002-2004收稿日期：2010-05-15；修回日期：1作者简介：杨治国（1964-），男，河南尉氏人，副教授，研究方向：水产动物病理与病害。2图1病鱼肌肉中的大量大型坏死结节和肝脏、脾脏、肾脏组织中的点状结节年在广东顺德某渔场打工，2005年回乡养殖加州鲈鱼，养殖技术参照广东顺德模式，2009年11月诊断时每公顷存塘量尚有3万余千克。为了尽快搞清此病发生的原因，找到有效的防治方法，作者对其病原及防治药物进行了研究，结果报告如下。1材料与方法1.1病鱼来源病鱼于2009年11月采自河南南阳池塘养殖的加州鲈鱼，体重450～600g。1.2病原菌分离取发病症状典型的濒死病鱼，带回实验室用70％的酒精棉球反复擦拭消毒病鱼体表，用无菌剪刀打开腹腔，无菌操作取肝、肾、脾组织上的结节，划线接种于罗-詹氏(LÖwenstein-Jensen)平板和TAS培养基，30℃培养7天，挑取形态特征一致的优势菌落用罗-詹氏平板纯化备用。1.3回归感染在125cm×45cm×55cm的水族箱中，每箱放养体重400-500g的健康加州鲈鱼10尾，连续充气，暂养1天后进行口灌、注射、创伤浸泡和浸浴感染。实验鱼在26±2℃条件下观察，每天换水1/3，发现死鱼及时捞出，解剖检查肌肉和内脏器官的病变，同时进行细菌再分离。1.4腹腔注射感染挑取罗-詹氏平板30℃培养10天的培养物，以无菌生理盐水制成1.2×108CFU/mL(在波长625nm处的吸光值为0.15)菌悬液，以腹腔注射0.5mL/尾的方法进行感染。对照组注射同量无菌生理盐水。1.5口灌感染实验实验鱼每尾口灌1mL菌悬液，对照组口灌同量无菌生理盐水。1.6创伤浸泡感染以无菌镊子快速撕掉试验鱼臀鳍上方左右侧鳞片各5-6片，将创伤后的鱼放入含菌量约为2.4×105CUF/mL的暴气自来水中暂养观察。对照组不加菌液。1.7浸浴感染选择体表无损伤的健康加州鲈鱼放入暴气自来水中，加入2ppm高锰酸钾消毒，24h后换水加入菌悬液，使含菌量约为2.4×105CUF/mL，暂养观察。对照组不加菌液。1.8病原体鉴定纯分离物在罗-詹氏平板上划线30℃培养7天观察菌落形态。参照文献1-7的检测项目，检测细菌的酶类产生、水解活性、营养源及温度、盐度耐受性等生理生化特征。检测试剂盒购于杭州天和微生物试剂有限公司。1.9药敏试验采用常规纸片法进行。接种病原菌于穆-欣氏琼脂(Mueller-Hintonagar，MHA)培养基上，贴上药敏纸片，30℃培养96h后，测抑菌圈直径，抑菌圈大小取平均数。所用化学疗剂药敏纸片购于杭州天和微生物试剂有限公司。2结果2.1病鱼症状及流行情况病鱼发病初期体表无明显症状，仅行动迟缓，食欲下降，离群上浮。随着病情发展，体表出现出血、溃烂、鳞片脱落，部分病鱼眼睛膨胀外突、腹部膨胀，严重病鱼的体表形成脓肿或瘘管，随后逐渐死亡。解剖检查，部分病鱼有腹水，病鱼肌肉、心脏、肝脏、3肾脏、脾脏、生殖腺、肠系膜等有明显的病变，布满大量直径1-20mm的黄白色结节(图1)，将结节内含物作涂片镜检，发现大量有分枝的短杆状或细长杆状的革兰氏阳性菌体，Ziehl-Neelsen抗酸染色呈弱阳性反应。该病发生于秋季(9-10月)，主要危害成鱼。霍姓养殖户养殖面积1/3公顷，存塘加州鲈鱼约1.1万千克，经解剖检查统计，群体发病率约33%。该病病程缓慢，二个月累积死亡率约12%，经济损失严重。2.2细菌分离加州鲈鱼肝、肾、脾组织上的结节在罗-詹氏平板和TAS平板上划线，30℃培养，在TSA平板上4天出现白色砂粒状有皱折隆起的菌落，在罗-詹氏平板上7天出现微黄色颗粒状有凸起的菌落。将菌落涂片观察，两种平板分离的培养物与直接用结节内含物涂片镜检所见菌体相同。2.3病原性人工接种实验结果表明，分离物对加州鲈鱼有致病性(表1)。腹腔注射接种后7天体表出现出血症状，13天出现首尾死亡，21天后全部死亡，剖检症状与自然发病相同。创伤浸泡接种后4天体表出现溃疡，11天出现瘘管，16天出现首尾死亡，42天累积死亡率85%，剖检存活鱼内脏都有大量黄白色结节。口灌感染组死亡1尾，剖检症状与自然发病相似，暂养结束剖检存活鱼只，内部器官正常。浸浴感染及各对照组无死亡，剖检鱼只内脏器官正常。从发病鱼只病灶分离的细菌其菌落、菌体形态和生理生化特性与从自然发病鱼只分离的细菌完全一致。表1回归实验结果组别实验尾数菌液浓度(CUF/mL)剂量(mL)接种后首次出现死亡的时间(d)42日累积死亡尾数死亡率(%)注射10，101.2×1080.51320100注射对照10生理盐水0.5—00口灌10，101.2×1081.01915口灌对照10生理盐水1.0—00创伤浸泡10，102.4×105—161785创伤浸泡对照10———00浸浴10，102.4×105——00浸浴对照10———002.4病原菌生物学特性分离菌MSN09生长缓慢，好氧，30℃时在TSA平板上4天出现可见菌落，7天后菌落呈白色砂粒状，有皱折隆起；在罗-詹氏平板上7天出现菌落，10天后菌落呈微黄色颗粒状，有凸起。菌体革兰氏染色阳性，弱抗酸，呈杆状、丝状或细长分支状，直径0.3-1.0μm，长2-5μm，丝状体可达5-50μm。不运动，不产生孢子。4.5%NaCl生长，40°C不生长。病原菌氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，还原硝酸盐，水解尿素、七叶灵和睾酮，不水解明胶、酪素、黄嘌呤、腺嘌呤，能利用柠檬酸盐和醋酸盐，具有诺卡氏菌的生理生化特征(表2)，与Nocardiaasteroides基本相同。根据病原菌的形态、生长和生理生化特征，确定从加州鲈鱼坏死结节病灶分离的病原菌属于诺卡氏菌(Nocardiasp.)。表2分离菌株的生理生化特性项目MS06MSN09项目MS06MSN09革兰氏染色Gram++麦芽糖Maltose−−抗酸性染色Acid-fast(+)(+)棉子糖RaffinoseN−运动性Motility−−鼠李糖RhamnoseN−氧化酶Oxidase−−蔗糖Sucrose−−4过氧化氢酶Catalase++海藻糖TrehaloseN+硝酸盐还原Nitrate++木糖XyloseN−水解：甘油Glycero++酪素CaseinN−肌醇Inositol−−酪氨酸Tyrosine−−甘露醇MannitolN−尿素Urea+(+)山梨醇SorbitolN−七叶灵Esculin++赤藓醇ErythritolN−明胶Gelatin−−半胱氨酸L-CysteineN+黄嘌呤XanthineN−苯丙氨酸L-PhenylalanineN−次黄嘌呤HypoxanthineN−醋酸盐AcetateN+腺嘌呤AdenineN−柠檬酸盐Citrate++睾酮TestosteroneN+生长：利用：20°CN+水杨苷SalicinN−30°C++纤维二糖CellobioseN−35°CN+阿拉伯糖Arabinose−−37CN+葡萄糖Glucose++40°CN−果糖FructoseN+4.5%NaCl++注：+，阳性；(+)弱阳性；−，阴性；N，没有检测。2.5药敏试验分离菌MSN09在MHA上生长良好，30℃培养96h后能清楚判断抑菌圈大小。MSN09对青霉素、四环素耐药(表3)。表3药物敏感实验结果药名纸片含量判读标准抑制效果药名纸片含量判读标准抑制效果链霉素Streptomycin10ug≥1522S卡那霉素Kanamycin30ug≥1822S青霉素GPenicillinG10U≥15—R四环素Tetracycline30ug≥1912R庆大霉素Gentamicin10ug≥1521S氟苯尼考florfenicol30ug≥1928S红霉素Erythromycin15ug≥2346S土霉素oxytetracycline30ug≥1932S注:R指耐药,S指高度敏感.—表示无抑菌圈,前面的数字表示抑菌圈的直径,单位为mm。3讨论