关于葡萄抗病基因的调研报告

关于葡萄抗病基因的调研报告前言葡萄是世界栽培面积最广，经济价值最高的果树之一，但葡萄生长常遭受各种病害危害，其中葡萄霜霉病是危害葡萄最为严重的病害之一。葡萄霜霉病源于北美，18世纪末传入欧洲，后几乎遍及所有的葡萄产区，多发生于温暖潮湿的环境。葡萄霜霉病主要危害葡萄叶片，严重时也侵染果穗、新梢等幼嫩组织。葡萄染霜霉病后，染病叶片的叶背会有白色霜状霉层，有的叶背会有坏死斑。果穗受害产生脱绿的病斑，也会有白色霜状霉层，容易干枯脱落。新梢被侵染会产生凹陷的黄褐色病斑，有时也会产生白色霜状霉层（贺普超，1994；Bananietal.，2014）。葡萄霜霉病是由真菌中的葡萄霜霉菌引起的病害，葡萄霜霉菌属于鞭毛菌亚门，卵菌纲，霜霉目，霜霉科，单轴霉属，是雌雄异株的二倍体活体营养型寄生卵菌。葡萄霜霉菌的侵染过程总是发生在潮湿的环境中，一般包括孢子囊萌发、游动孢子释放和萌发以及侵入寄主组织三个时期。其侵染循环大体又可分为有性繁殖和无性繁殖两个阶段。雄器和藏卵器通过受精作用产生融合细胞，随后二倍体卵孢子形成。卵孢子在病叶等病残组织中越冬，这是病害的初侵染源。第二年春，卵孢子在适宜的温度和湿度下产生孢子囊，孢子囊萌发后释放出游动孢子，游动孢子借风雨到达开放的气孔处，通过产生的菌丝侵入寄主组织内部，完成有性生殖的初侵染阶段。初侵染完成后，经过5-10天的潜育期，病斑气孔处伸出孢子囊梗和孢子囊，由孢子囊再产生游动孢子，进行再次侵染，既是葡萄霜霉菌通过无性繁殖完成的二次侵染阶段（孔庆山，2004；Allègreetal.，2007；Rossietal.，2007）。葡萄霜霉菌侵染的最适温度为22~25℃，相对湿度为95%以上，其侵染程度主要随周围环境和寄主葡萄抗性不同而有所差异。研究表明不同品种的葡萄对霜霉病的抗病性/感病性不同（Yuetal.，2012）。一般认为，圆叶葡萄对霜霉病完全免疫，美洲种葡萄对霜霉病有明显的抗性，欧亚种葡萄普遍感霜霉病。关于山葡萄对霜霉病的抗性一直存在争议。贺普超（1984）认为山葡萄易感霜霉病。宋润刚（1998）等研究发现山葡萄不抗霜霉病，但品系间感病程度差异较大。Wu等（2010）认为一些山葡萄品种属于抗霜霉病葡萄品种。Yu等（2012）通过实验发现一些山葡萄尽管发病率和病情指数都较高，但它们的菌密度值都要低于欧亚种葡萄，说明山葡萄中至少存在部分抗病性，因此被归类于较抗类别。在育种研究中，美洲种和山葡萄都是良好的抗性品种资源。目前在生产上针对病害仍以化学防治为主，在防治葡萄霜霉病方面主要依赖于喷施波尔多液。化学杀菌剂防治病害不仅增加了生产成本，造成严重的环境污染，还可能影响葡萄的品质。此外，化学杀菌剂加速了菌株的变异，而又产生新的化学灭菌剂，使之成为一个无休止的循环。霜霉病等疾病的传播，增加了人们培育新的抗病品种的迫切需求，将抗霜霉病性状与具有优良品质的葡萄性状相结合，培育抗病品种是解决问题的更为安全、长久有效的途径。2正文2.1葡萄抗霜霉病研究进展人们发现已经克隆的抗病基因产物存在一些相似的保守结构域如NB-ARC结构域、LRR结构域等，利用这些结构域设计简并引物，并从植物基因组DNA中进行扩增，扩增的产物与抗病基因有较高的同源性，这些即为抗病基因同源序列（RGA），它为筛选抗病基因或抗病相关基因提供了一种有效手段。近年来，Seehalak等（2011）在抗霜霉病的杂种葡萄NY88.0507.01和易感种黑皇后中克隆得到91个RGA序列，其中易感种黑皇后中得到42个RGA，说明RGA在抗性品种和易感品种中都可以获得。此外，WangP等（2013）根据NBS保守结构域设计的简并引物在三种抗霜霉病葡萄（红地球、贝达和藤稔）和易感品种（无核白）的基因中扩增出10个RGA序列，与已知的R基因序列比对相似度很高，系统发生表明它们分布在两个主要NBS-LRR蛋白分支上。实时定量PCR分析出RGA1、RGA2、RGA5和RGA23在感染霜霉菌后显著表达，推测可能与葡萄抗霜霉病有关，使得克隆出抗霜霉病基因成为可能。同时RGA也可作为分子标记，构建遗传图谱。DiGaspero和Cipriani（2003）将葡萄的两个RGA家族转化为与抗病性相关的STS标记，为进一步筛选抗霜霉病基因提供了条件。TantasawatPA等（2012）把13个RGA-SSCP（抗性基因类似物单链构象多态性）标记与71种抗霜霉病的葡萄性状进行分析实验，这71种葡萄是抗病品种和易感品种7个杂交组合所得到的子代。用简单的线性回归分析RGA-SSCP标记，结果发现有1个RGA-SSCP标记与抗霜霉病有关。研究还发现RGA-SSCP标记在葡萄早期就能有效的检测出对霜霉病的抗性。许多如抗霜霉病这样的农艺性状均是数量性状遗传，因此很难控制葡萄育种复杂的性质，随着分子技术的发展，与遗传因素相关的性状变异能够作为数量性状基因座（quantitativetraitloci(QTL)）被定位到以分子标记为基础的遗传图谱上。到目前为止，研究人员利用大量的分子标记已经将13个霜霉病抗性基因位点定位在葡萄的第4、5、7、8、9、12、14、17和18号染色体上（Merdinogluetal.，2003；Fischeretal.，2004；Welteretal.，2007；Bellinetal.，2009；Margueritetal.，2009；Zyprianetal.，2006；Zhangetal.，2009；Blasietal.，2011；Moreiraetal.，2011；Schwanderetal.，2012；Venutietal.，2013）。法国INRA研究人员利用圆叶葡萄与欧亚种葡萄Syrah连续回交两代，通过对BC2的139株苗进行抗性鉴定、与抗性基因紧密连锁的分子标记筛选及连锁分析，于2003年和2006年在圆叶葡萄中发现霜霉病抗性基因位点Rpv1和Rpv2，并将其分别定位在染色体12号和18号（Merdinogluetal.，2003；Wiedemann-Merdinogluetal.，2006）。Welter（2007）和Bellin（2009）等人通过作图群体：抗病品种Regent与感病品种Lemberger的杂交后代，利用398个标记构建了19个连锁群的遗传图谱，并通过该图谱确定了一个霜霉病抗性的主效和微效QTL（Rpv3和Rpv4），它们分别位于染色体18号和4号。Marguerit等人（2009）利用欧洲种赤霞珠与美洲河岸葡萄GloiredeMontpellier的138株杂交个体定位了两个新的和霜霉抗性相关的抗性位点Rpv5、Rpv6，分别位于染色体9号和12号。Rpv6是第二个定位在第12号染色体的抗性位点，Rpv6和Rpv1的标记位置分析表明两个位点确实是不相同的。Bellin等人（2009）在第7号染色体上发现了和抗性相关的Rpv7位点，是在霞多丽和Bianca葡萄的杂交个体上定位的。2011年，Blasi等人在东亚种山葡萄（V.amurensis）上发现了抗性位点Rpv8（Blasietal.，2011），并且定位到第14号染色体上。同年，Moreira等人通过Bianco和河岸葡萄的杂交群体，在染色体7号上定位了一个与霜霉病油状病斑直径相关的抗性位点Rpv9（Moreiraetal.，2011）。2.2我的课题本研究首次对我国本土东亚种山葡萄进行全基因组重测序，为研究我国特有葡萄基因组序列奠定基础。其次扩充了葡萄物种多样性基因组信息。研究对葡萄NBS类抗病基因家族在不同品种之间的差异进行归纳总结。为筛选出重要的葡萄抗病基因奠定基础。下图是获取候选基因的技术路线，后续研究是对候选基因进行筛选，从中确定抗病基因，并进行转基因植株培育，得到抗病性植株。3结论目前在葡萄中已经分离鉴定的抗霜霉病基因只有一个。但是在该研究中抗性基因RPV1仅对一部分分离菌具有抗性，仍对少部分分离菌不显示抗性，因此还需要进一步研究抗性品种中的协同抗性基因。此外还需对葡萄表皮细胞抗病信号的传导进行研究。植物的抗病与激素相关联，现在对葡萄中的激素合成代谢过程仍不明确，因此无法确定抗性基因起到抗病作用的机理。国内外的研究焦点也不一样，国外主要是从致病菌霜霉菌的角度研究效应蛋白入手，研究效应蛋白诱导葡萄中的受体蛋白，通过分析蛋白质得到抗病基因。国内主要集中在葡萄抗病品种中通过现代基因组学的方法找到可能的抗病基因。不同的着眼点有不同的优缺点，各有利弊。从现在的研究成果来说，从山葡萄中筛选抗病基因具有操作上的可行性。