兽药的检测

第二节兽药兽药残留来源及危害兽药残留是动物性食品最重要的污染源之一。它是指给畜禽等动物使用药物后蓄积或贮存在动物细胞、组织和器官内的药物或化学物的原形、代谢产物和杂质。目前绝大多数食品动物在生长、生产过程中长期接受至少1-2种兽药及药物添加剂。在全球动物保健品市场上，用于非治疗目的的药物添加剂占据相当大的比例。目前，受到公众关注的、已经或可能危及人体健康的兽药品种主要有两类，第一类为禁用药物，如兴奋剂类、性激素类、皮质激素类等。这类药物残留的危害最大，是国内外兽药残留监控的重点。第二类为毒性较大、休药期较长的药物，如磺胺类、四环素类、阿维菌素类等。这类药物的毒性相对较大，在动物体内消除缓慢、残留时间较长，或者它们可能具有潜在的“三致”（致癌、致畸、致突变）作用及对人体产生其他明显的有害作用。动物性食品中的药物残留对人体的危害性主要表现为各种慢性、蓄积毒性，如过敏反应、“三致”作用、免疫毒性、发育毒性以及激素（样）作用等。兽药残留(residuesofveterinarydrug)是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品（如鸡蛋、奶品、肉品等）中原型药物或其代谢产物，包括与兽药有关的杂质的残留。一般以μg/ml或μg/g计量。最高残留限量(maximumresiduelimit，MRL)，所谓最高残留限量即对食品动物用药后产生的允许存在于食品表面或内部的该兽药残留的最高量。主要残留药物有以下几类：1．抗生素类：包括青霉素、链霉素、金霉素、土霉素、四环素、泰乐菌素等。2．呋喃药类：包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃呾啶等。3．磺胺药类；4.抗球虫药；5.激素药类；6.驱虫药类。二．抗生素类药物这类药物多为天然发酵产物，是临床应用最多的一类抗菌药物，如青霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、螺旋霉素、链霉素、土霉素、金霉素等。青霉素类最容易引发超敏反应，四环素类、链霉素有时也能引起超敏反应。轻至中度的超敏反应一般表现为短时间内出现血压下降、皮疹、身体发热、血管神经性水肿、血清病样反应等，极度超敏反应可能导致过敏性休克甚至死亡。长期摄入含氨基糖苷类残留超标的动物性食品，可损害听力及肾脏功能。1.原理：样品经提取，微孔滤膜过滤后直接进样，用反相色谱分离，紫外检测器检测，与标准比较定量，出峰顺序为土霉素、四环素、金霉素。标准加法定量。2.试剂：3.操作步骤：用高氯酸水溶液作为提取液是因为4种抗生素都能够溶解于水，高氯酸可沉淀水产品中的蛋白质。样品中的蛋白质沉淀更加完全，有利于提取液的过滤，但高氯酸浓度过大不仅会对溶液中的抗生素起一定的破坏作用，影响测定的灵敏度，而且也会造成试剂的浪费，综合考虑过滤的效果及测定的灵敏度，选取高氯酸浓度为5%。3.操作步骤：用高氯酸水溶液作为提取液是因为4种抗生素都能够溶解于水，高氯酸可沉淀水产品中的蛋白质。样品中的蛋白质沉淀更加完全，有利于提取液的过滤，但高氯酸浓度过大不仅会对溶液中的抗生素起一定的破坏作用，影响测定的灵敏度，而且也会造成试剂的浪费，综合考虑过滤的效果及测定的灵敏度，选取高氯酸浓度为5%。三、乙烯雌酚残留量的测定1.原理样品匀浆后经甲醇提取过滤,注入HPLC柱中,经紫外检测器在波长230nm处测吸光度,同条件下绘制工作曲线,乙烯雌酚含量与吸光度在一定浓度范围内成正比，样品与工作曲线比较定量第三节毒素一、麻痹性贝类毒素的检测—生物法1.原理根据小鼠注射贝类抽取液后的死亡时间，查出鼠单位，并按小鼠体重，校正鼠单位，计算确定每100g贝肉内的PSP的含量。所测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的麻痹性贝类毒素的总量。2.仪器和设备均质器。天平(感量0.1g)。离心机。pH计。秒表。玻璃皿：烧杯、量筒、容量瓶、搅拌棒等。注射器：1mL。注射器针头：8＃。3.试剂盐酸溶液：0.1mol/L。盐酸溶液：5mol/L。氢氧化钠溶液：0.1mol/L。麻痹性贝类毒素(Saxitoxin)标准溶液：100μg/mL，经酸化，含有20％的乙醇作为保护剂，冷藏保存，无限期稳定。3.操作步骤（1）样品的制备牡蛎、蛤及贻贝用清水彻底洗净贝类外壳，切断闭壳肌，开壳，用清水淋洗内部去除泥沙及其他外来杂质，仔细取出贝肉，切勿割破肉体。收集贝肉沥水5min(避免贝肉堆积)，捡出碎壳等杂物，将贝肉均质。开壳前不能加热或用麻醉剂。扇贝取可食部分(闭壳肌)用作检测。「青口配炸薯條」是法國北部小酒館最典型的小食，地位如同英國的炸魚薯條和美國的漢堡薯條。這個大型的小食最適合與家人或朋友分享，BrasseriedeL'ile就提供一大盤重800克的煮青口再加無限任食炸薯條的套餐(港幣$258)。不想吃薯條的話，還有另一個400克青口的輕盈選擇(港幣$138)。青口的煮法也極多元化，最經典的「Mariniere」式採用白酒、洋蔥、西芹、百里香、月桂和牛油烹調；最具異國風情的則運用了西班牙辣腸、番紅花、香蒜和洋蔥製作。贝类罐头将罐内所有内容物(包括贝肉组织及汁液)于均质器中均质。大容量的罐头，则过滤分离贝肉及汁液，分别称重，将固形物和汤汁按比例混合，充分均质。冷冻贝类在室温下，使冷冻的样品(带壳或脱壳的)呈半冷冻状态，按1规定的方法清洗、开壳、淋洗、取肉、均质。（2）提取取100g按1处理的样品于800mL烧杯中，加0.18mol/LHCl溶液100mL充分搅拌，检查pH(pH应为2.0～4.0)。需要时，可逐滴加入5mol/LHCl溶液或0.1mol/LNaOH溶液调整pH，加碱时速度要慢，同时需不断搅拌，防止局部碱化破坏毒素。将混合物加热，并徐徐煮沸5min，冷却至室温，调节pH至2.0～4.0(切勿4.5)。将混合物移至量筒中并稀释至200mL。将混合物倒回烧杯，搅拌至均质状，使其沉降至上清液呈半透明状，不能堵塞注射针头即可，必要时将混合物或上清液以3000r/min离心5min，或用滤纸过滤。保留进行小鼠注射用的足量液体。（3）小鼠试验①以感量为0.1g的天平将小鼠称重并记录重量。每个样品注射3只小鼠。②对每只试验小鼠腹腔注射1mL提取液。注射时若有一滴以上提取液溢出，须将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠。③录注射完毕时间，仔细观察并用秒表记录小鼠停止呼吸时的死亡时间(到小鼠呼出最后一口气止)。④若注射样品原液后，1只或2只小鼠的死亡时间大于7min，则需再注射至少3只小鼠以确定样品的毒力。若小鼠的死亡时间小于5min，则要稀释样品提取液后，再注射另一组小鼠(3只)，得到5min～7min的死亡时间；稀释提取液时，要逐滴加入0.1mol/L或0.01mol/LHCl溶液，调节pH至2.0～4.0。①数量充足②老鼠中的小白鼠的基因序列和人类的差不多③实验专用白鼠的生物学意义较大④其实很多实验用猩猩等与人更近似的动物做最好，但使用猩猩太昂贵了。为什么要用小鼠4.计算根据小鼠的死亡时间，在表8-2中查出相应的每毫升注射液的鼠单位数MU，将存活鼠的死亡时间视为大于60min即相当于0.875MU。若试验动物重量19g或21g，则根据表8-3查出重量校正系数k。二、黄曲霉毒素测定—微柱筛选法1。原理样品提取液中的黄曲霉毒素被微柱管内硅镁型吸附层吸附后，在波长365nm紫外光灯下显示蓝紫色荧光环，其荧光强度与黄曲霉毒素在一定的光密度范围内成正比例关系.若硅镁型吸附剂层未出现蓝紫色荧光，则样品为阴性（方法灵敏度为5-10ug/kg).由于在微柱上不能分离黄曲霉毒素b1,b2,g1,g2,所以测得结果为总的黄曲霉毒素含量.2.仪器紫外光灯：8W～100W，带有波长365nm滤光片；微柱管：内径0.4cm，长12cm的玻璃管，为加液方便上加一段粗管；微柱管架；微量注射器：50mL。3.试剂无水硫酸钠：过40目～80目筛、60目～100目筛或80目～100目筛；石油醚：沸程60℃～90℃或30℃～60℃；甲醇水溶液：（55＋45）；中性氧化铝：层析用100目～200目；酸性氧化铝：层析用100目～200目；硅镁型吸附剂：层析用100目～200目；展开剂：丙酮－三氯甲烷（1＋9）；脱脂棉：用索氏提取器以二氯甲烷为溶剂提取2h，挥干后贮于瓶中保存(是不可燃低沸点溶剂，常用来代替易燃的石油醚、乙醚等)；注：层析用氧化铝、硅镁型吸附剂、无水硫酸钠应在120℃活化2h，密塞，贮于干燥器内可保存一周。3。操作步骤（1）提取花生油：称取5g混匀的样品,置于小烧杯中。用25ml石油醚将样品移于100ml分液漏斗中,再用25ml甲醇水溶液,分次洗涤烧杯,一并加入于100ml分液漏斗中。振摇2min,待静置分层后,将下层甲醇水溶液放入50ml具塞量筒或比色管中。加入10ml三氯甲烷,振摇2min，加水至50ml，轻轻颠倒4次，以促使其分层，打开塞，待分层后,用连接水泵装置的滴管抽去上层的甲醇水溶液。再加水至50ml，轻轻颠倒4次，洗去残留的甲醇。再同上法将上层水层抽掉，加入4g无水硫酸钠，盖严，间断摇动10min，即为样品提取液，此样液每毫升相当0.5g样品。花生：称取20g磨细过10目筛孔混匀的样品，置于250ml具塞锥形瓶内。加100ml甲醇水溶液与30ml石油醚，并在塞上涂一层水，盖严防漏，振荡30min。过滤时，先用力摇匀后，立即将样液大量地倒入放有折叠式的约8.5cm直径的快速定性滤纸的漏斗中，滤入50ml量筒或比色管中，注意勿将上层石油醚带进滤液中。收集25ml甲醇水溶液，然后加入10ml三氯甲烷，振摇2min,打开塞，待分层后，将上层甲醇水抽掉，加水至50ml，轻轻颠倒4次，洗去残留的甲醇。再同上法将上层水层抽掉，加入4g无水硫酸钠，盖严，间断摇动10min，即为样品提取液，此样液每毫升相当0.5g样品。玉米:称取20g磨细、过20目筛孔的混匀样品,置于250ml具塞锥形瓶中,加入4ml水使样品湿润后，再加入40ml三氯甲烷，振摇30min，然后加入10g无水硫酸钠，摇匀，放置10min，使之脱水，经折叠式快速定性滤纸滤于具塞试管中，此即样品提取液，此样液每毫升相当0.5g样品。AFB1溶于油脂不溶于石油醚，易溶于甲醇、三氯甲烷等溶剂，石油醚主要起溶解分层作用。(2)测定1.微柱管Ⅰ的制备(供甲醇-水-石油醚提取法用)：取微柱管置于微柱架上按先后顺序加入下列各试剂，脱脂棉(作底层)，1cm80～100目无水硫酸钠，0.5cm硅镁型吸附剂,0.5cm80～100目无水硫酸钠，1cm中性氧化铝，1cm酸性氧化铝，1.5cm40～80目无水硫酸钠。装管时管要垂直，每装一种试剂要适当敲紧，两种试剂之间界面要平，柱管要随装随用，或装好后立即放于干燥器内保存，等所需的柱装完后再一起上样液。以免吸附剂暴露于空气中的时间较长，降低活性。2.微柱管Ⅱ的制备(供三氯甲烷水提取法用):按先后顺序加入下列各试剂,脱脂棉(作底层),0.5cm60～100目无水硫酸钠,0.5cm硅镁型吸附剂,0.5cm60～100目无水硫酸钠,2～2.5cm中性铝,1cm60～100目无水硫酸钠,脱脂棉(铺顶层)。3.微柱层析:取装好的微柱管Ⅰ或Ⅱ,加入1ml提取的样液,另取2支加入1ml每毫升相当0.0025及0.0050μg的标准使用液,相当于样品的浓度依次为5、10μg/kg。另取1支加入1ml三氯甲烷作为标准空白管，待加液流至顶层时，即加入1ml丙酮－三氯甲烷展开剂(1:9)展开,在加样或展开时，柱管均要保持垂直，待展开剂流完后，即可观察结果，最好在2h内进行观察。