农业生物技术学报

农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2008,16(6):1001~1005*基金项目：国家高技术研究与发展(863)项目(No.2006AA02Z174和No.2006AA03A243）和国家重点基础研究发展规划(973)项目(No.2003CB114201)资助。**通讯作者。Authorforcorrespondencd.博士，教授，主要从事芽胞杆菌分子生物学研究。Tel:[phone];Fax:[phone];E-mail:[e-mail].收稿日期：2008-02-20接受日期：2008-04-07·研究论文·苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry7Ba1溶解性分子改良*朱自敏，宋荣，余子全，喻子牛，孙明**(华中农业大学生命科学技术学院，农业微生物学国家重点实验室，武汉430070)摘要：苏云金芽胞杆菌（）杀虫晶体蛋白Cry7Ba1需要在强碱性缓冲液中(pH12.5)才能溶解，而且只有溶解后才能对小菜蛾()表现出毒力，其50为1.33滋g/mL。分别用Cry1Ac和Cry1C晶体蛋白的C-半段替换Cry7Ba1的C-半段，结果发现当Cry7Ba1的C-半段被替换后，重组晶体蛋白与Cry1Ac和Cry1C等其它晶体蛋白一样在弱碱性条件下(pH9.5)能有效溶解，而且重组晶体蛋白对小菜蛾的杀虫活性没有发生明显变化，其50分别为1.32和1.39滋g/mL。结果还显示重组晶体蛋白不需要经过体外溶解就能对小菜蛾表现出杀虫活性。研究结果揭示Cry7Ba1晶体蛋白难溶的特性是由其C-半段结构决定的，通过改变其C-半段结构改善溶解性，为该晶体蛋白在害虫生物防治中的应用提供了可能。关键词：苏云金芽胞杆菌；Cry7Ba1；晶体蛋白；溶解性中图分类号:S188文献标识码:A文章编号:1006-1304(2008)06-01001-05MolecularImprovementofSolubilityofCry7Ba1CrystalfromZHUZi-min,SONGRong,YUZi-quan,YUZi-niu,SUNMing**TheCry7Ba1crystalproteinfromcanbedissolvedatleastatpHvalueof12.5,andcanexhibittoxicitytothethirdstagelarvaofwitha50valueof1.33滋g/mLonlywhenitisdissolved.Inthisstudy,theC-ter-minalhalfofCry7Ba1wasreplacedbythatofCry1CandCry1Ac,respectively.Theresultsindicatedthat,whentheC-terminalhalfofCry7Ba1wassubstituted,thecrystalformedbytherecombinantcrystalproteinscouldbedissolvedinalkalinebuffer(pH9.5)asthatofCry1AcandCry1Cdid,andexhibitedtoxicitytowithvalueof1.32and1.39滋g/mL,respectively.Thetoxi-citieswerenearlyequalwithCry7Ba1.Thestudyindicatedthattheconstructedrecombinantcrystalproteinalsoshowedtoxicitywith-outdissolving.ThesedatasuggestthatthepropertyofinsolubilityofCry7Ba1crystalisassociatedwiththestructureofC-terminalhalf,whichcanimprovethesolubilitythroughswappingtheC-terminalhalfofCry7Ba1,andsuppliespossibilityforthecrystalproteinbiocontrolapplication.;Cry7Ba1;crystalprotein;solubility苏云金芽胞杆菌()在芽胞形成过程中会产生由一种或几种杀虫晶体蛋白(in-secticidalcrystalproteins,ICPs)组成的伴胞晶体，该晶体蛋白对多种昆虫有毒杀活性（Crickmore,2006）。敏感昆虫吞食芽胞晶体混合物后，晶体蛋白在中肠碱性环境及一系列蛋白酶的作用下，原毒素降解为60~65kD的激活毒素,然后结合到中肠上皮细胞的特异性位点上使细胞膜形成微孔而改变细胞的渗透性，最后细胞裂解导致昆虫死亡(Bravo.,2007)。典型的杀虫晶体蛋白（如Cry1、Cry4和Cry7）的结构总体上可分为两部分，氨基端半段(N-半段，N-terminalhalf)和羧基半段（C-半段，C-termi-nalhalf）。其中N-半段为抗胰蛋白酶的毒性区，而C-半段的功能还不是很明确(Schneptf,1998)。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建玉A5.2kbfragmentharboringclonedintopHT304atthesiteof玉,ErmrandAmprRecombinantgene(5'-terminal+3'-terminal)clonedintopHT304atthesiteof玉andR玉Recombinantgene(5'-terminal+3'-terminal)clonedintopHT304atthesiteof玉andR玉strain,44△(渍80△M15)endBtsubsp.acrystalliferousmutant()CryB-containingpBMB0495BMB171containingpBMBLCBMB171containingpBMB0632BMB171containingp0184BMB171containingp0185来源ResourcesAranteandLereclus(1991)StoredinthislabStoredinthislabStoredinthislabThisworkThisworkStoredinthislabStoredinthislabStoredinthislabStoredinthislabStoredinthislabThisworkThiswork根据Cry1晶体蛋白序列特征，一般推测认为C-半段对维持晶体蛋白稳定性与晶体形成有关(Crickmore.,2006)。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白对靶标昆虫发生毒杀活性首先必须要让晶体蛋白在昆虫肠道碱性环境下溶解活化才能变成有活性的毒素(Bravo.,2007)。由不同晶体蛋白组成的伴胞晶体具有不同的溶解性，在pH9.5条件下，Cry1类晶体蛋白以及Cry3A晶体蛋白可被溶解，而Cry2类晶体蛋白只有在pH10.5才能溶解。以色列亚种(subsp.)的伴胞晶体，在pH10.5溶液中Cry4D和CytA晶体蛋白可被溶解出来，Cry4A和Cry4B晶体蛋白不能溶解(YamamotoandIizuka,1983)。Cry1Ac和Cry1C为典型的Cry1类晶体蛋白，对鳞翅目昆虫具有毒性，分子量为130kD左右，形成菱形晶体，在弱碱性环境中（pH9.5）能被溶解，这一点与靶标昆虫肠道pH值是相对应的(PigottandEllar,2007）。苏云金芽胞杆菌中华亚种(subsp.H40)的伴胞晶体由Cry7Ba1杀虫晶体蛋白组成，该伴胞晶体在常规溶解的碱性环境(pH9.5)条件下不能溶解，而必须在强碱性条件下(pH12.5)才开始溶解，没有溶解的Cry7Ba1伴胞晶体不表现出杀虫活性，而溶解后的蛋白对小菜蛾表现出很高的毒力（资料未发表）。本研究利用Cry1Ac和Cry1C的C-半段置换Cry7Ba1晶体蛋白的C-半段，试图改变Cry7Ba1晶体蛋白的溶解性，为更好地利用该晶体蛋白防治害虫提供基础资料。1材料和方法1.1菌株和质粒实验所用的菌株和质粒见表1。大肠杆菌()和苏云金杆菌()分别在37℃和28℃培养。抗生素使用浓度为氨苄青霉素(Amp)100滋g/mL，红霉素(Erm)25滋g/mL。1.2酶和主要试剂各种限制性内切酶、DNA聚合酶和T4DNA连接酶均购自大连TaKaRa公司；蛋白质分子量标准购自深圳晶美生物有限公司；其它生化试剂及药品购自美国Sigma等公司；DNA胶回收和PCR产物回收试剂盒购自美国Omega公司。1.3培养基实验采用LB培养基活化菌种，ICPM培养基培养苏云金芽胞杆菌到芽胞成熟(Arvidson.,1989)。1.4供试昆虫供试的小菜蛾()是华中农业大学昆虫中心饲养的稳定的敏感品系，生物测定时采用三龄幼虫进行生测。1.5引物设计分析已知的Cry1C、Cry1Ac和Cry7Ba1蛋白的氨基酸序列，根据其胰蛋白酶酶切位点，设计重组质粒N-和C-半段互换的引物，且不改变重组蛋白N-和C-半段的结构域（表2）。1002PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建重组质粒的构建目的基因片段的PCR扩增、质粒抽提、酶切反应、电泳鉴定、DNA片段回收、连接反应和大肠杆菌的转化均参照Sambrook(1989)。重组基因的DNA测序由北京奥科生物公司完成。1.7苏云金杆菌的电击转化重组质粒转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171(Turgeon,2006)。转化条件：0.2cm的电转杯，电压212kV，电阻400赘，电容25滋F。1.8晶体蛋白SDS-PAGE重组Bt菌株在ICPM液体培养基中培养36h至芽胞成熟。取等体积的发酵液离心收集菌体，用1mol/LNaCl和去离子水分别洗涤3次，加入等体积的2倍加样缓冲液重悬菌体，充分混匀后在沸水中煮5~10min，离心后取上清10~20滋L点样。按常规方法在Bio-Rad电泳仪上进行稳流电泳，用考马斯亮蓝R-250染色。1.9晶体蛋白的溶解性测定苏云金芽胞杆菌在ICPM培养基中培养至芽胞成熟后，15000r/min离心5min各收集2mL菌体，分别用1mol/LNaCl和