内质网内的泛素化机制

内质网内的泛素化机制当蛋白质经过内质网（endoplasmicreticulum，ER）的时候，会有一套“质控”系统暂时将那些新合成的蛋白质“扣留”下来，帮助它们成熟。只有折叠正确的蛋白质才会被“释放”，而那些不能成熟的蛋白质则会被继续“关押”，但是这样会损害内质网的功能。因此，为了维持内环境的稳态，蛋白质质控系统会将这些“不合格产品”移交到胞质溶胶当中，在那里，被蛋白酶体降解掉。随着在越来越多的病理过程当中发现了内质网质控系统功能缺陷的现象，我们也开始逐渐意识到细胞内这条作用机制的重要性。在所有人类基因组编码的蛋白质当中，大约有20%的蛋白质被认为是分泌性蛋白质。这些分泌性蛋白质在到达它们的最终的目的地之前都需要先经过内质网的处理，这些目的地广泛分布在细胞各处，例如细胞膜上，各种胞内或胞外的腔室（Exocytoticandendocytoticcompartments），以及细胞外表面等等。内质网不仅仅只是提供了一个“容器”，它同时还提供了众多的分子伴侣，帮助蛋白质折叠、成熟。不过虽然细胞提供了这些帮助，蛋白质在合成过程当中仍然非常容易出错。大约有1/3的新生蛋白质会在翻译过程中或者在翻译后数分钟之内被降解掉。这些蛋白质是因为在转录过程、翻译过程、成熟过程或折叠过程中出现了某些错误，或者各个亚基之间的合成不平衡，从而不能形成正确的构象而被降解的。即使是成熟的蛋白质也会因为各种诸如高能辐射、化学损伤、代谢产物等等环境因素而被损伤。这些损伤蛋白会聚集在一起，也会出现功能障碍，这都会影响到内质网以及细胞内环境的稳态。因此，进化机制赋予了内质网控制蛋白质质量的功能，这套质控系统可以在好几个层面对蛋白质进行监控，维持内质网的完好性。在蛋白质刚刚合成时它们会通过一个特异性的N连接聚糖（N-linkedglycanstructure）结构被保护起来，可以免遭降解。随后，那些可能发生错误折叠的蛋白质会被内质网中甘露糖苷酶（mannosidase）生成的一种“聚糖密码（glycancode）”所标记（图1）。然后，锚定在内质网膜上的泛素连接酶会破译该“密码”，需要被降解的蛋白质被转运出内质网，经由泛素化途径被26S蛋白酶体降解掉，该过程也被称为内质网相关的降解途径（ER-associateddegradation，ERAD）。发生错误折叠的蛋白质并不是唯一一个进入ERAD系统的底物，ERAD系统还可以调控甾醇合成途径，它可以在甾醇过多的情况下降解掉甾醇合成途径中的限速酶，以此来控制合成速度。图1蛋白质在内质网内的降解途径。错误折叠的蛋白质在内质网内被降解掉需要以下几个步骤。首先（步骤1），附着在内质网膜上的泛素连接酶与其他辅助因子一起识别出折叠错误的蛋白质。然后在步骤2所示的错位阶段，蛋白质经由一目前尚不清楚的通道被转运进入胞质溶胶之中。步骤3中，在内质网的胞质溶胶面，底物蛋白被E3泛素连接酶泛素化修饰。最后在步骤4中，在AAA+ATP酶和Cdc48蛋白的作用下，底物蛋白从膜上被去除掉，进入26S蛋白酶体，被降解处理。科研人员们最开始借助生化技术和遗传筛选的方法发现了一批ERAD系统的组成单位。不过现在，由于发现了细胞对发生折叠错误的糖蛋白进行降解的途径，大家的目光又都投向了ERAD系统的功能研究方向。在本文中我们将介绍内质网蛋白质控系统是如何能够选择、处理出错的蛋白质，但同时又不会降解掉新生蛋白的机制。因为ERAD途径似乎是非常保守的一条途径，可见于从酵母细胞到哺乳动物细胞等种类众多的真核生物细胞，因此我们选择酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）作为研究对象，来研究其中的机制，同时这也丰富了我们的知识，又进一步扩展了研究范围（以往只对哺乳动物进行过这方面的研究）。在图2中，我们给出了酵母细胞和哺乳动物细胞中ERAD系统的组成因子，以及这些因子在细胞内的分布情况。图2酵母细胞和哺乳动物细胞中的蛋白质降解机制。分子伴侣和糖基水解酶47（glycosylhydrolase-47）家族蛋白Mns1andHtm1能发现折叠错误的蛋白质，并使其与内质网膜结合连接酶Doa10、RMA1、HRD相结合。当底物蛋白与内质网胞质溶胶面结合后就会被E3连接酶泛素化修饰。所有的泛素连接酶复合体都含有一个重要的含有指环催化结构域的E3连接酶，一个E2结合酶以及其他一些辅助因子蛋白。AAA+ATP酶Cdc48蛋白能使泛素化修饰的底物蛋白从内质网膜上脱离下来。配体蛋白（adaptorproteins）Rad23andDsk2能促使泛素化修饰的底物蛋白进入26S蛋白酶体被降解，同时，Png1蛋白能借助Rad23蛋白的作用使糖蛋白去糖基化。图中酵母蛋白以紫色表示，哺乳动物蛋白以绿色表示。1.葡聚糖与蛋白质折叠内质网内蛋白质控系统最主要的作用就是将未正确折叠的蛋白质扣留在内质网中。Hsp70伴侣蛋白以及葡聚糖依赖的分子伴侣蛋白（glycan-dependentchaperone）会与非天然蛋白结合，防止其转运至高尔基体，而且还可以与氧化还原酶类（oxidoreductases）蛋白一起帮助构象不正确的蛋白重新折叠，改变其构象。传统的观点认为，蛋白运送装置只会在蛋白质正确折叠之后才根据其氨基酸序列中的“离开信号（exitsignals）”将其转运出内质网。另一种观点则认为，在决定是否将蛋白质转运出内质网时存在一个比较宽泛的标准，是依据蛋白质的能量（级）状态和细胞的折叠环境而定的（图3和背景知识1）。图3内质网中的蛋白质处理途径。蛋白质经由Sec61蛋白被转运入内质网中之后（如图中步骤1所示），未折叠的蛋白质在分子伴侣的作用下可以被折叠成正确的构象F，如图中步骤2所示。外向转运因子能选择这些折叠正确的蛋白质并将它们运送至高尔基体，如图中步骤3和4所示。而滞留因子则会阻止未折叠的蛋白质离开内质网，如图中步骤5所示。分子伴侣会努力帮助任何折叠发生错误的蛋白质恢复成未被折叠的状态，使其能够重新进行正确的折叠，如图中步骤6所示。在步骤7中，滞留因子会使折叠错误的蛋白质停留在内质网中，最终，这些异常蛋白质以及一部分处于折叠中间状态的蛋白质会经胞质溶胶途径被降解，如图中步骤8所示。KU→F和KU→M表示反应的平衡常数。背景知识1：关于蛋白质外向转运的灵活标准通常大家都会认为外向转运机制（exportmachinery）只会运输那些折叠正确、构象天然的蛋白质，而所有的异常蛋白质都会被降解掉。这说明内质网（endoplasmicreticulum，ER）会使用一种固定的，统一的，以野生型蛋白质的构象为标准的质量控制标准。但是这种理论却无法解释为什么有些细胞能分泌突变型蛋白质。在内质网中究竟是一种什么标准在进行蛋白质的质量控制工作。了弄清楚由甲状腺素转运蛋白（transthyretin，TTR）引起的组织特异性的淀粉样变性疾病（tissue-specificamyloiddiseases）的发病机制，Sekijima等人证明了TTR突变体蛋白的分泌情况与“折叠稳定性分值（foldingstabilityscore）”有关。这个分值集合了热力学稳定性情况（thermodynamicstability），即伸展的多肽链与折叠状态多肽链之间的Gibbs自由能差异（Gibbsfree-energydifference）；和动力学参数，比如TTR形成四聚体的速率等等。相应的，不同组织蛋白分泌效率上的偏差也似乎是由于分子伴侣、外向转运机制以及为细胞外向转运机制制定各自标准的ERAD系统之间各自活性上的差异造成的。比如，在某种细胞中，某一特定蛋白可能会被转运出去，但是在另一种组织细胞中却可能会被降解，这是因为分子伴侣的低活性降低了用于判断蛋白是否被外向转运的“折叠稳定性分值”的阈值。Wiseman等人在Sekijima试验的基础之上又开发出了一套关于蛋白质折叠外向转运的定量模型，即FoldEx模型，该模型将内质网中复杂的内环境网络系统简化成了几条基本的代谢通路，包括易位（translocation）、不需要分子伴侣的蛋白折叠途径和需要分子伴侣的蛋白折叠途径、蛋白外向转运途径以及ERAD途径，每一条途径都被看做一个独立的单元（图3）。上述这每一条途径的作用都与酶的作用一样，可以通过Michaelis–Menten动力学常数表示出来。Wiseman等人结合了几种不同的方程，用数学的方法描述了蛋白质以折叠平衡常数（foldingequilibriumconstant）为基础的外向转运效率，该效率与热力学稳定性情况有关。这种理论研究的方法正确的解释了我们在试验中观察到的现象，即在一个特定的细胞特异性环境当中，蛋白质折叠分子的绝对热力学稳定性决定了它们的外向转运效率。FoldEx模型同样也解释了为什么即使是非常稳定的蛋白质，比如CTFR等包含多个结构域的蛋白质或者是多亚基组成的蛋白质复合体，如果折叠的过慢也会被降解掉，该模型告诉我们，蛋白质的外向转运效率取决于ERAD途径与外向转运途径之间的活性对比情况，也取决于蛋白质发生错误折叠的速度，这也就是说当蛋白质更容易发生错误折叠时，蛋白质的外向转运效率就会降低。FoldEx模型重点强调了“可适应性标准（adaptablestandard）”的概念，是可适应性标准决定了某种细胞中每一种蛋白质的外向转运效率。该标准是由蛋白质氨基酸序列复杂的相互作用以及蛋白质折叠时所处的局部微环境（比如分子伴侣及帮助蛋白质折叠的酶、代谢产物、外向转运装置和ERAD装置等情况）等因素所决定的，而且该标准还可以在细胞处于应激环境时进行调整，帮助细胞适应相应的环境。各种不同的蛋白质都可以竞争这些细胞装置，结果导致某种蛋白的外向转运效率会取决于某一时刻表达的蛋白酶体的多少。FoldEx模型是第一个将蛋白质折叠相关以及内质网折叠活性、ERAD和外向转运装置相关热力学参数和动力学参数结合起来的理论模型，该模型将会是我们未来试验研究中的好帮手。大部分在内质网中合成的蛋白质多肽都会被N连接低聚糖（N-linkedoligosaccharides）修饰。低聚糖糖基转移酶（Oligosaccharyltransferase）能催化葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡糖胺酶2低聚糖（glucose3-mannose9-N-acetylglucosamine2oligosaccharides）与进入内质网蛋白所含的Asn-X-Ser/Thr基序中的天冬酰胺（asparagine）之间共价连接（图4）。这些N连接聚糖赋予了被修饰蛋白更多的亲水性，同时也能起到帮助蛋白质折叠的作用。而且，这些聚糖分子结构本身的修饰信息也能为我们提供当下的蛋白质的折叠状况信息。聚糖分子最外侧的两个葡萄糖分子会被内质网中的α葡萄糖苷酶（α-glucosidases）水解切除掉，以表明该蛋白正处于折叠过程之中（图4）。在这个阶段，葡聚糖依赖的分子伴侣蛋白会与该蛋白相连。在哺乳动物细胞中，钙联接蛋白（calnexin，是内质网中的一种磷酸化的钙结合蛋白）或钙网织蛋白（calreticulin）会与单葡糖基化修饰的糖蛋白（monoglucosylatedglycoproteins）相连接，帮助其成熟。当新生蛋白与这些伴侣蛋白分子解离之后，内质网内的α葡萄糖苷酶II（α-glucosidase-IItrims）分子会去掉残余的葡萄糖分子，防止新生蛋白再次与钙联接蛋白或钙网织蛋白相连。这些进行了正确折叠获得天然构象的糖蛋白随后就可以离开内质网了。但是那些需要更多帮助才能成熟的蛋白质又是如何获得正确构象的呢？作为哺乳动物细胞内质网内最主要的折叠装置，UDP葡萄糖（UDP-glucose）糖蛋白葡萄糖基转移酶（glycoproteinglucosyltransferase，GT或者叫UGGT）能识别出非天然蛋白质，并使其聚糖分子A分支重新葡萄糖基化，这样，就可以再次与钙联接蛋白或钙网织蛋白相连，进行重新折叠（图4b）。这种钙联接蛋白-钙网织蛋白循环（calnexin–calreticulincycle）只是哺乳动物细胞内蛋白质