农科院—分子遗传学

农科院—分子遗传学2002年博士入学考试题名词解释（每个4分，共计40分）1、反义RNA：反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子,也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合,即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式，最早是在E.coli的大肠杆菌素的ColE1质粒中发现的,许多实验证明在真核生物中也存在反义RNA。近几年来通过人工合成反义RNA的基因,并将其导入细胞内转录成反义RNA,即能抑制某特定基因的表达,阻断该基因的功能,有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。同时也暗示了该方法对肿瘤实施基因治疗的可能性。反义RNA的来源：细胞中反义RNA的来源有两种途径∶第一是反向转录的产物，在多数情况下,反义RNA是特定靶基因互补链反向转录产物,即产生mRNA和反义RNA的DNA是同一区段的互补链。第二种来源是不同基因产物，如OMPF基因是大肠杆菌的膜蛋白基因，与透性有关，其反义基因MICFZE则为另一基因。反义RNA的分类和作用机制：反义RNA的分类和作用机制：下表总结了原核细胞内天然存在的11种反义RNA。这些反义RNA按其作用机制可经分为三大类。Ⅰ类:这类反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或编码区，引起翻译的直接抑制(ⅠA类)或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶Ⅲ的敏感性增加，使其降解(ⅠB类)。Ⅱ类:这类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制尚不完全清楚，可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后会引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变，因而阻止了核糖体的结合。Ⅲ类:这类反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。ticRNA(transcriptioninhibitorycomplementaryRNA)是大肠杆菌中CAP蛋白(cAMP结合蛋白)的mRNA的反义RNA。ticRNA的基因的启动子可被cAMP-CAP复合物所激活，从CAPmRNA的转录起始位点上游3个核苷酸处开始，以CAPmRNA的模板DNA链的互补链为模板，合成ticRNA。ticRNA具体长度不清楚，但是它是5'端一段正好和CAPmRNA的5'端有不完全的互补，可以形成双链的RNA杂交体。而在CAPmRNA上紧随杂交区之后的是一段约长11bp的A，U丰富区。这样的结构十分类似于ρ不依赖性的转录终止子的结构，从而CAPmRNA的转录刚刚开始不久后即迅速终止。从这个例子中我们可以看到CAP蛋白合成的自我调节作用。当CAP合成达一定量后，即可与cAMP结合成cAMP-CAP复合物。再激活ticRNA的启动子转录出ticRNA，反过来抑制CAP-mRNA的合成。反义RNA的功能：在原核生物中反义RNA具有多种功能，例如调控质粒的复制及其接合转移，抑制某些转位因子的转位，对某些噬菌体溶菌-溶源状态的控制等。下文仅举数例。1.调控细菌基因的表达:反义RNA对编码CAP的基因的调控作用已如前述。这里再介绍一下micFRNA对ompF基因的表达的调控。ompF蛋白质是大肠杆菌的外膜蛋白的主要成分这一。micFRNA是从另一基因(ompC基因)附近的DNA序列转录而来，和o-mpFnRNA的5'端有70%的序列互补，因此在体外micFRNA可以抑制ompFmRNA的翻译。但是这种抑制作用在体内是否重要尚有疑问，因为缺失micF基因的菌株其ompF蛋白的表达只受到轻微的影响。2.噬菌体溶菌/溶源状态的控制:反义RNA也参与了λ和P22噬菌体的溶菌/溶源状态的控制。P22噬菌体编码一种抗阻遏蛋白Ant，它可以抑制许多λ样噬菌体的阻遏蛋白与DNA的结合。这对于刚刚感染细胞的P22建立λ样原噬菌体(prophage)是有益的。但是Ant必须在严格的控制下，否则Ant的过分表达必将阻止溶源状态的建立，而成为溶菌性的噬菌体。Ant蛋白质表达的控制是利用反义RNA(sarRNA)能与antmRNA的翻译起源区互补结合，从而抑制antmRNA翻译成Ant蛋白。在λ噬菌体中cⅡ蛋白控制着溶菌或溶源状态的选择。cⅡ蛋白可以激活λPre启动子，该启动子控制的基因是λ噬菌体整合作用所必须的，且同时能抑制λ噬菌体的复制。cⅡ蛋白的另一功能是延缓λ晚期基因的表达，其作用机制是cⅡ蛋白激活PaQ的启动子，转录出PaQRNA。PaQRA是编码Q蛋白的mRNA的反义RNA。因此，PaQRNA能与QmRNA配对杂交而抑制其翻译，而Q蛋白早已知道是晚期基因表达的激活蛋白。cⅡ基因本身的表达还受到称为oopRNA的反义RNA的调控。oopRNA与cⅡ基因的3'端互补，但其具体作用机制尚不清楚。3.IS10转位作用的抑制:outRNA是一种反义RNA，可以和IS10编码的转位酶mRNA(INRNA)5'端结合而抑制其翻译，当细胞内只有一个考贝IS10时，只能生成很少量的outRNA，故转位酶仍可生成。但当IS10的考贝数增多时，outRNA愈来愈多，其控制作用亦明显增强，所以称为多考贝抑制现象。这种现象可以防止IS10的过量堆积引起的细胞损害。人工合成构建反义RNA既然反义RNA在原核生物中对基因表达起着重要的调控作用，那末人工设计在天然状态下不存在的反义RNA来调节靶基因的表达，想必也是可能的。这已在不少实验中得到证实。1.由于目前对靶mRNA的SD序列的上游区的结构了解甚少，因此，在要设计Ⅱ类反义RNA用于和靶mRNASD序列上游区结合，以期达到调节该mRNA翻译的目的是比较困难的。2.Ⅲ类反义RNA是和mRNA的起始处结合而形成类似ρ-不依赖性的转录终止子而使转录水平上抑制靶基因的表达。因此，要设法在靶mRNA上找到一段连续的U序列，就可以设计出反义RNA，与该U序列上游的mRNA链互补，以形成ρ-不依赖性终止子。理想的作用位点是在靶mRNA的5'端上游的非编码区，以免受核糖体的影响。3.只要靶基因的核苷酸顺序已经知道，就可以人工设计出Ⅰ类反义RNA。有时还可设计同时具有Ⅰ类和Ⅲ类反义RNA功能的反义RNA。我们还可以设计出天然存在的反义RNA的反义RNA来。这样就可以拮抗原始反义RNA对靶mRNA的抑制作用。而达到激活或加强某个靶基因的表达的目的。然而并不是所有的mRNA对其相应的Ⅰ类反义RNA都敏感。例如，有的mRNA寿命很短，只有1-2分钟，它们和反义RNA结合的机会较少，因而就较不敏感。反之，另一些mRNA则很稳定，寿命可达十多分种，则其对相应的反义RNA的抑制作用就很敏感。此外，反义RNA本身的稳定性有很大的实际意义。显然，稳定的反义RNA对靶mRNA的调节作用比不稳定的反义RNA要好。使反义RNA分子稳定的方法如下：[1]反义RNA3'端带有茎环结构或类似ρ-不依赖性终止子结构时，可以稳定RNA分子。[2]Gorski等还发现在T4噬菌体的基因32mRNA的5'端上游的茎环结构及其附近的序列亦可稳定RNA分子。所以在设计反义RNA基因时，最好将产生3'及5'端这种二级结构的序列克隆在反义RNA基因的两端。Hirashima等1986年发现，针对靶mRNA的SD序列和AUG区域的反义RNA，要比单纯对编码区域的反义RNA更为有效。1989年Hirashima又发现，针对SD序列和它的上游区域(但不包括AUG)的反义RNA更为有效。在真核生物中，针对5'端非编码区的反义RNA更有效。但也有实验表明针对第一内含子的反义RNA也同样有效。现在设计反义RNA基因是时应注意之点总结如下：[1]长的反义RNA并不一定比短的反义RNA更为有效。[2]在原核生物中针对SD序列及其附近区域的反义RNA可能更有效。[3]在真核生物中，对应于5'端非编码区的反义RNA可能比针对编码区的反义RNA更有效。[4]尽量避免在反义RNA分子中出现自我互补的二级结构。[5]设计的反义RNA分子中不应有AUG或开放读框，否则该反义RNA亦会与核糖体结合而影响其与靶mRNA的配对结合。[6]进一步还可以将带有ribozyme结构的RNA连在反义RNA的3'端尾上，当反义RNA与靶mRNA杂交后，即可利用其酶活性来降解靶mRNA。此外，为了增强反义RNA的作用，还可以采取一些额外措施，例如:[1]由于反义RNA对靶mRNA的抑制作用有剂量依赖性，所以在构建反义RNA基因时，要选择强的、可以诱导的启动子以增强反义RNA本身的表达。[2]构建许多个反义RNA基因串连在一起，以得到线性重复的多拷贝基因，对提高反义RNA的表达也有利。[3]RNA酶Ⅲ可以降解RNA:RNA杂交体，所以在构建反义RNA基因时，可将RNA酶Ⅲ的基因也同时转化到靶细胞中并进行表达。这样，当反义RNA与靶mRNA结合后，RNA酶Ⅲ即可将其降解。这显然有利于反义RNA的抑制作用。近年来，有关反义RNA的研究进展迅速，已经应用到抗病毒感染，研究癌基因的作用机制，探索肿瘤治疗的可行途径等方面。在今后一段时间内，有关反义RNA的研究肯定将会有更加迅速的进展和更广阔的应用前景。反义RNA技术：随着分子生物学和遗传工程的发展，基因治疗应运而生，反义技术是其中一种，它的基础是根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列的反义核酸，从而抑制特定基因的表达，包括反义RNA、反义DNA及核酶（Ribozyme），它们通过人工合成和生物合成获得。（一）反义RNA，根据反义RNA的作用机制可将其分为3类：Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ降解；Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。(二)反义DNA是指一段能与特定的DNA或RNA以碱基互补配对的方式结合，并阻止其转录和翻译的短核酸片段，主要指反义寡核苷酸，因更具药用价值而倍受重视。(三)核酶(ribozyme)是具有酶活性的RNA，主要参加RNA的加工与成熟。天然核酶可分为四类：(1)异体催化剪切型，如RNaseP；(2)自体催化的剪切型，如植物类病毒、拟病毒和卫星RNA；(3)第一组内含子自我剪接型，如四膜虫大核26SrRNA；(4)第二组内含子自我剪接型。利用反义技术研制的药物称反义药物。反义药物作用于产生蛋白的基因，因此可广泛应用于多种疾病的治疗，如传染病、炎症、心血管疾病及肿瘤等。与传统药物比较反义药物更具选择性及效率，因此也更高效低毒。基于上述特点反义药物已成为药物研究和开发的热点。而且反义技术还可以应用于生物科学的基础研究。2、核酶核酶一词用于描述具有催化活性的RNA,即化学本质是核糖核酸(RNA),却具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子,有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。核酶的功能很多,有的能够切割RNA,有的能够切割DNA,有些还具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。核酶（ribozyme）是具有催化功能的RNA分子。核酶又称核酸类酶、酶RNA、类酶RNA。反应大多数核酶通过催化转磷酸酯和磷酸二酯键水解反应参与RNA自身剪切、加工过程。发现美国科学家T.Cech和S.Altman发现了核酶(ribozyme)。最早发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，在体外高浓度Mg2+存在下，与留下的RNA部分(MIRNA)具有与全酶相同的催化活性。后来发现四膜虫L19RNA在一定条件下能专一地催化寡聚核苷酸底物的切割与连接，具有核糖核酸酶和RNA聚合酶的活性。影响核酶的发现对于所有酶都是蛋白质的传统观念提出了挑战。1989年，核酶的发现者T.Cech和S.Altman被授予诺贝尔化学奖3、hnRNA：heterogeneousnuclear核内不均一RNA为存在于真核生物细胞核中的不稳定、大小不均的一组高分子RNA之总称。在核内主要存在于核仁的外侧。认为hnRNA多属信使RNA（mRNA）之