冷鲜猪肉中假单胞菌的分离及其鉴定方法

冷鲜猪肉中假单胞菌的分离及其鉴定方法一、课堂报告依据的知识背景假单胞菌属于细菌的一科，是无核细菌假单胞菌是假单胞菌科的1属。专性需氧的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌，呈杆状或略弯。菌体大小(0.5～1)×(1.5～4)微米。具端鞭毛，能运动。有些株产生荧光色素或（和）红、蓝、黄、绿等水溶性色素，不发酵糖类。大多数菌的适温为30℃。DNA中的G+C克分子含量为58～70%。存在于土壤、淡水、海水中。目前已确认有29种，其中至少有3种对动物或人类致病。二、撰写课堂报告的目的通过撰写课堂报告让学生积极主动思考问题，学习掌握假单胞菌的相关基础知识，明晰冷鲜猪肉中假单胞菌的具体分离技术和鉴定方法，从而拓展学习掌握食品微生物学技术的基本操作原理和方法，同时也能提高学生主动发现问题、思考问题、解决问题的能力。三、撰写课堂报告的思路首先通过网上查阅资料和查阅书本资料的方式了解假单胞菌的定义及相关基本知识，在此知识背景下找到冷鲜猪肉中假单胞菌的类型及产生机制，并且查找资料明确微生物的分离纯培养技术，通过所学知识和所找资料在掌握假单胞菌特性的基础上找到其相对应的分离方法和鉴定技术。此外在此基础上列举几种假单胞菌不同的几种相关分离和鉴定方法，分析讲解假单胞菌分离方法及鉴定技术的时候，积极主动的提出相关问题并加以思考，找到这个过程中的注意事项并在课堂上展开讨论，积极思考拓展有关食品微生物学中微生物分离和鉴定的方法。四、课堂报告的正文（一）假单胞菌的基本相关知识及猪肉中的假单胞菌1、冷鲜肉中产生假单胞菌的条件：鲜肉在零度左右的环境中，一般10天以后，若肉体表面比较干燥，则逐渐出现霉菌生长；若肉体表面润湿，则有假单胞菌、无色杆菌等革兰氏阴性的低温菌生长并占优势。2、冷鲜猪肉中假单胞菌引发腐败的机理：肉类表面繁殖的微生物属于需氧性微生物，表面上的微生物繁殖后，肉组织即发生变质并逐渐向组织内部伸展。因为假单胞菌属于一种需氧性的细菌，所以其引起的腐败主要是在有氧条件下。具体可分为以下几种：（1）、发黏：肉类表面有黏液状物质产生，这是因为微生物在肉表面生长繁殖形成菌苔及产生黏液的结果。发黏的肉块切开时会出现拉丝现象，并有臭味产生。（2）、变色：微生物污染肉后，分解含硫氨基酸产生H2S，H2S与肌肉组织中的血红蛋白反应形成绿色的硫化氢血红蛋白，这类化合物积累于肉的表面时，形成暗绿色的斑点。还有许多微生物可产生各种色素，使肉的表面呈现多种色斑，例如，深蓝色假单胞菌产生蓝色斑，一些霉菌可形成白色、黑色、绿色霉斑。（3）产生异味：脂肪酸败可产生酸败气味，主要是由无色菌属或酵母菌引起的。3、假单胞菌的形态及染色特征假单胞菌属是一类革兰氏阴性、直或微弯的需氧杆菌。细胞呈卵圆、短杆状以至长杆状形态。大小一般为0.5~1微米*1.5~4.0微米。无柄、鞘和芽孢。有鞭毛（单鞭毛或多鞭毛）而运动，少数菌物运动性。DNA的G+C含量为58%~70%。胞浆中含浓染颗粒及空泡。在透射电镜下观察，可见异染颗粒、脂质颗粒、板层状内膜结构等特殊结构。值得注意的是，板层状内膜系统仅见于少数菌属，如紫色光合细菌、硝化细菌、甲烷氧化菌等，其功能与光合作用及氧化磷酸化过程有关。假单胞菌属为有机化能异养菌，代谢为呼吸而非发酵，有些是兼性化异养菌，能利用氢气和二氧化碳为能源。分子氧是普遍的电子受体，有些能脱氮而利用硝酸盐为替代的受体。除能利用脱氮作用以厌氧呼吸的一些外，均为严格或专性需氧菌。菌苔虽不明显呈色，但部分菌可产生水溶性色素和荧光色素。4、假单胞菌的生化特性假单胞菌氧化糖类只产生少量的酸，蛋白胨糖水不适用于测定酸的产生，因为产生的酸常被蛋白胨产生的碱所中和。用铵盐培养基易测定酸的产生因在此培养基中糖是唯一碳源。过氧化氢酶阳性，假单胞菌能产生和分泌许多胞外酶，包括脂酶、卵磷酯酶等。明胶酶的产生对假单胞菌的分类也显得很重要。（二）、分离纯培养技术纯种分离技术是微生物学中重要的基本技术之一。从混杂微生物群体中获得单一菌柱纯培养的方法称为分离。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。尽管所分离、纯化的菌种不同，但分离、筛选及纯化新菌种的步骤基本相似，具体分离方法有如下几种：1、用固体培养基分离纯培养法不同的微生物在特定的培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，这可以作为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌以及真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，因此，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。而常用的分离、培养用的固体培养基是琼脂固体培养基平板，平板分离微生物纯培养技术也是多年来一直用来分离各种菌种的最常用方法，具体有以下几种方法：稀释倒平板法（微生物计数）、涂布平板法（常用的纯种分离法）、平板划线分离法（适用于分离细菌和酵母菌）和稀释摇管法（主要是对氧气敏感厌氧微生物）。假单胞菌主要运用的是平板划线法：2、用液体培养基分离纯培养法对于大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，然而像一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等却仍需用液体培养基分离来获得纯培养。通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法，采用稀释法进行液体分离时必须在同一稀释度的许多平行试管中，大多数（一般超过95%）表现为不生长。3、单细胞（单孢子）分离法采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养，以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。单孢子分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，它对操作技术的要求比较高，多用于高度专业的科学研究。4、选择培养分离法自然界中不是所有的微生物都能在一种培养基中培养分离，根据不同的特性需要选择不同的培养基来培养，这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离法，主要包括：（1）、用选择培养基进行直接分离：主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以选择。（2）、富集培养：主要是利用不同微生物间生命活动特点的不同去制定特定的环境条件，使原本在自然环境中占少数的微生物数量大大提高后再通过稀释倒平板或平板划线等操作得到纯培养物。5、二元培养物法培养物中只含有二种微生物，并且有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。因纯培养时营养要求往往极端复杂，制备纯培养基太过复杂，因而大多采用二元培养法培养，例如，纤毛虫、变形虫和黏菌。（三）冷猪肉中假单胞菌的分离纯培养技术冷猪肉中的假单胞菌也属于细菌的一种，故而根据它的具体形态和生理生化培养特征可利用革兰氏染色法分离。（1）、革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：a、载玻片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。b、草酸铵结晶紫染1分钟。c、自来水冲洗，去掉浮色。d、用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。e、用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。酒精脱色为整个流程最关键的一步。f、用蕃红染液或者沙黄复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。（2)、也可通过观察细菌的群体形态来分离假单胞菌可根据菌落的斜面菌苔特征来区分出假单胞菌。具体方法是在斜面培养基上划线接种，培养3到5天观察菌苔隆起形状、表面形状、表面光泽、颜色、质地等项。如铜绿色假单胞菌的斜面特征是菌苔丰厚、光滑、少带红色转红灰色，有荧光色素渗入培养基中，呈绿色到橄榄棕色。（四）冷鲜猪肉中假单胞菌的鉴定技术经分离后的单一菌落是否就是目的菌还需要经过一系列的感官和性能鉴定后才能确定。下面是微生物菌种的初步鉴定：1、通过群体形态观察，获取单一纯种：在划线或稀释等培养后的平板上，挑取形态与目的菌相同大小的单一菌落移接至固体斜面培养基，待做初步鉴定和保种用。2、细胞形态观察：通过显微镜对细胞个体形态特征的观察，可以较方便地识别不同种类的微生物。3、细胞染色观察：对形态上难以区分的微生物，通过细胞染色手段进行鉴别，就像革兰氏染色方法就是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。它是通过细菌细胞壁的化学组成不同而分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。某些细菌具有芽孢、荚膜、鞭毛和异染颗粒等特殊结构，也可用特殊的染色方法进行鉴别。4、生理生化性能鉴定：生化反应常用来鉴别在形态方面不宜区别的微生物。它是根据各类微生物体内的酶系统和代谢产物的不同，通过生化反应测定微生物的代谢产物进而鉴定的。例如糖发酵实验、甲基红实验和吲哚实验等。5、生存环境测试：每种微生物都有自己最佳的生存条件，包括温度、酸碱度、氧、渗透压等。将每个条件做一系列梯度，培养待鉴定菌株，观察是否与目的菌相一致。6、生产性能测定：分离得到的纯种微生物是否具有生产或所需研究的性能，必须进行性能测定后才决定取舍。性能测定的方法一般分为初筛和复筛两种。（五）以几种常见假单胞菌的分离和鉴定来举例说明1.绿脓杆菌细菌显微镜检查铜绿色假单胞菌，为细长的革兰氏阴性小杆菌，长1.3～3.0m，宽约0.5m，在静置培养下常呈多形性，无孢子，菌体一端有细长鞭毛，运动极为活跃。可产生多种水溶性色素，其中能使脓汁变为绿色的绿脓色素。2.马鼻疽杆菌分泌物作涂片检查可发现Gram阴性的马鼻疽杆菌，若用吕氏碱性美蓝着色，菌体会呈深浅交替的染色部分。3.类鼻疽血清学检查以耐热多糖抗原或类鼻疽菌素作间接血凝试验或补体结合试验，在急性期一周末常出现强阳性，2～5周时90%患者都可出现阳性。4、椰毒假单胞菌的检验具体步骤是：（1）增菌：无菌环境下培养48小时。（2）分离、纯化培养：划线接种PDA平板，培养24~48小时，观察平板上生长菌落的形态，挑取可疑单个菌落，进行革兰氏染色及氧化酶试验，再挑取革兰氏染色阴性的菌落再点种卵黄琼脂平板及SS琼脂平板分别培养48h和24h。（3）生化实验：从纯培养的PDA斜面上挑取少量菌苔，分别接种按单项实验要求分别进行观察。（4）血清学分型鉴定：包括O抗原的制备和O抗原的鉴定。（5）毒性实验：包括产毒培养、毒力测定和米酵菌酸测定。（六）做假单胞菌分离和鉴定实验的注意事项A、无菌操作要求1.、接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。2.进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。3.接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。4.进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。8.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。B、无菌间使用要求1.无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。2.无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。3.无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。4.处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。5、在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置C、消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经过灭菌后方能使用。主要包括干热和湿热