北方园艺生姜组织培养的影响因子

-1-生姜组织培养的影响因子尚小红，周生茂※，文俊丽，梁任繁，康红卫（广西农业科学院蔬菜研究所南宁530007）摘要:生姜是重要的辛辣类蔬菜作物，长期以来用地下块根无性繁种，所带的病毒病菌常常导致产品产量和品质降低。目前组织培养是提高生姜产量和品质最为有效的方法。本文从外植体选择、外植体消毒方式、培养基、蔗糖浓度、生长调节物质及培养条件等方面对生姜组织培养进行综述，并阐明了目前生姜组织培养存在的问题和展望了其应用前景。关键词:生姜；组织培养；影响因子ImpactfactoroftissuecultureofgingerShangXiao-hong,ZhouSheng-mao*,WenJun-li,LiangRen-fan,KangHong-wei1(VegetableResearchInstituteofGuangxiAcademyofAgriculturalSciencesNanning530007)AbstractGingerasasortofimportantandpungentvegetablecropshasoftenloweryieldandqualityinproductbecauseitsundergroundtuberousrootisasexuallypropagatedasannualseedlingandtooklotsofvirusesandpathogenicbacteria.Todate,themosteffectivecountermeasureforimprovingyieldandqualityofgingeristissueculture.Inthepaper,tissuecultureofgingerwasreviewedfromchoiceofexplant,sterilizingmethodofexplant,culturemedium,sucroseconcentration,growthregulator,andcultureconditionaswell.Theexistingproblemofgingertissuecultureatthepresentwaselucidatedanditsprospectofapplicationwasdone.KeywordsGinger;tissueculture;impactfactor生姜（Zingiberoffcinale.Rosc.）是姜科重要的辛辣类蔬菜作物，多年生单子叶草本，生产上多为一年生栽培[1]，现在已广泛栽培于世界各亚热带、热带地区。生姜由于其营养丰富，药用效果好，已成为重要的调味蔬菜和医药、化工及食品项目来源：广西农业重点科技计划项目（NK200813）。第一作者：尚小红（1982-），女，湖北随州人，硕士，研究实习员，专业方向为蔬菜育种与栽培，电话：[phone]；shxh789@gxaas,net。※通讯作者：周生茂（1970-，男，广西桂林人，博士，副研究员，专业方向为蔬菜育种与栽培，电话：[phone]；maomaozhou70@gxaas,net。-2-工业原料；加上其经济价值高，耐储运，近年来一直受到外商的青睐，出口量呈逐年增加趋势，成为我国主要的特产创汇蔬菜之一。由于生姜不开花或很少开花，在育种上很难利用有性繁殖，而只能靠少数品种长期无性繁殖，从而导致姜植株体内积累多种病毒，产量下降，品质退化，抗逆性下降[1]。生姜种质资源的繁殖和保存也主要依靠种姜在田间种植来进行，这样不仅繁殖系数低、费用高，也容易导致资源材料的丢失。随着生物技术的发展，近年来，植物组织培养技术有了很大发展，一大批植物的组织培养获得了成功，并取得了显著的经济效益和社会效益[2]。组织培养技术也应用到了生姜的生产上，取得了良好的经济效益，在生姜生产上越来越显出强大的应用价值。组织培养在生姜上的应用首先体现在脱毒上，生姜脱毒以后，植物长势强，产量显著提高，抗病(特别是姜瘟病)性增强[3]。目前在我国许多地区都建立了生姜无病毒繁殖体系，并逐渐走向市场化。此外，采用生姜组培苗替代姜块将大大节省种姜用量，提高生姜的产量和品质，获得更好的经济效益[4]。同时，使用组织培养可以克服生姜种质资源因为自然灾害和病虫害所导致的丢失，并可对植物品质进行改良，通过改变生姜染色体组成和基因结构，达到改良生姜品质的目的。生姜的组织培养受到多方面因素的影响，本文从外植体选择、外植体消毒方式、培养基、蔗糖浓度、生长调节物质及培养条件等方面对生姜组织培养的影响因子进行综述。1外植体的选择由于植物不同的器官和组织对离体培养的响应是不同，导致其形态发生的能力也不同[5]，所以外植体的种类是影响组织培养效果的主要因素之一。生姜组织培养常用的外植体有茎尖分生组织、幼茎、叶片、叶鞘组织、芽尖、花粉、子房、花芽等，其中最常用的外植体是茎尖分生组织，尤其在生姜组培脱毒上，茎尖分生组织被选作唯一的外植体，进行了较多的研究，取得了较好的效果[4-7]。此外，梁称福[8]以黄姜幼茎为外植体，诱导出愈伤组织和丛生芽；郭启高等[9]利用叶片或叶鞘组织进行培养，由叶或叶鞘切段经诱导愈伤组织成苗；薛寒青[10]以生姜芽尖组织进行培养；黄学林[11]利用生姜花粉诱导出愈伤组织。Nazeem[12]等以成熟的花序为材料，从中剥取子房进行培养，在离体条件下对其授粉，得到的种子用来培养成苗，所得苗经锻炼具有较高的移栽成活率；Neeta等[13]以花芽为外植体，培养得到了再生植株。此外，即使是同样的器官，由于其生理或年龄的差别，也会影响组织培养的效果。一般情况下幼嫩的外植体较容易获得再生植株。春季植物生长旺盛，再生能力最强，是进行组织培养的最适季节。因此，生姜组培应根据实际条件选择适-3-宜的外植体与时间。2外植体的消毒方式生姜的组培研究中，初代接种污染率高，因此外植体消毒是影响试验成败的关键环节。目前对生姜外植体的消毒方式主要包括以下几种：2.1表面消毒多数实验采用先将外植体洗干净后，在自来水下冲洗30min，移到接种室，在超净工作台上用70%酒精消毒30s，再用浓度0.1%HgCl2浸泡灭菌10-20min，无菌水洗涤5-6次，无菌吸水纸吸干外植体表面水分后进行接种[14-16]。有些研究者在酒精处理之后，加上1%的NaClO溶液浸泡灭菌30min，进一步降低了污染率[7，17]。2.2热处理脱菌传统的植物脱菌一般在35-38℃条件下持续对种苗处理5-6周，使病菌钝化失活，但效果不理想。高山林等[18]根据热处理脱菌原理，改进了热处理方法，即在50℃下处理5min，然后在无菌条件下取分生组织进行培养，脱菌效果良好。在刘小阳和宣朴[14，19]的研究中有相同的结果。2.3抗生素处理生姜通常带有内生细菌，纯粹的表面消毒不能有效控制其对生姜的污染，如果加大表面消毒的强度，则生姜的芽点变黑，出现药害现象，抑制其后期的生长，因此需要采取表面消毒与适宜的抗生素处理相结合的方式。薛寒青[10]在基本培养基中外加1g/L青霉素10mL、1g/L卡那霉素10mL，姜芽脱菌试验染菌率为0，脱菌效果良好；韦金洋[15]将生姜茎尖接种于含20-40mg/L利福平抗生素的培养基中消毒灭菌效果佳，但茎尖分化率比不加利福平的有所降低。Singh-DK等[20]在生姜初代接种时，将茎尖接种到含抗生素（尤其是硫酸链霉素或青霉素-链霉素500倍混合液）的分化培养基中，可以抑制杂菌丛生。表面消毒是最基本也是必要的消毒方式，实际操作中，可根据需要辅以热处理脱菌及抗生素处理，以更好的降低生姜外植体的初代接种污染率。3培养基随着植物生理学和生物化学研究的不断深入，培养基越来越复杂，成分也越来越多，组织培养的基础培养基有MT、MS、SH、White、B5等，生姜的组织培养一般采用较多的是MS培养基[5]。张延国[21]的研究表明，当添加6.0%蔗糖时，B5培养基培养的组培苗平均每株结0.77个姜块，且大小重量小，而MS培养基上的组培苗平均每株能结2.59个姜块，且大小重量大，计算结姜指数（单-4-株结姜数*平均重量*平均直径），MS指数为0.28，而B5仅为0.05，说明同等条件下，MS培养基比B5更适宜生姜组培。梁称福等[8]的研究表明1/2MS与MS相比，用1/2MS的培养基生根更粗壮，在空白的1/2MS上添加一种生长素或生长素和分裂素的培养基上都能生根，但是根的数量、粗细、长度不同。郑永强[22]的研究表明，适当提高诱导培养基中的大量元素至2MS，可以提高根状茎平均单球重以及诱导率。刘建成等[7]在诱导生姜试管苗生根时，直接使用自来水或干净的河水作为生根培养液，且没有灭菌，生根率达99.5%以上，但前提条件是茎苗长到了5-9cm高，而且生根所需要的时间也相对较长。4蔗糖浓度碳源是植物组织培养不可缺少的物质，它不仅能够给外植体提供能量，而且也能维持一定的渗透压，生姜组织培养中常用碳源为蔗糖，且在组织培养各个阶段所需要的蔗糖浓度是不一样的。宣朴[19]指出茎尖分化的培养基3%的蔗糖浓度；张耀华[23]发现最适宜鲁大姜试管苗增殖的蔗糖浓度为6%；张延国[21]认为蔗糖浓度在4%-12%时有试管姜形成，当蔗糖浓度为8%时，诱导形成的试管姜总数、姜块直径、姜块总重皆是同水平下的最高值；郑永强[22]对生姜组培各个阶段的适宜蔗糖浓度均进行了研究，发现生姜试管苗快繁培养基的蔗糖浓度以5%为好，生根培养基的蔗糖浓度应为2%，进行根状茎诱导时的蔗糖最佳浓度为8%-11%；Bhat-SR等[24]研究表明，培养基中蔗糖的浓度在9%~12%时，生姜组培苗有根状茎产生，并且蔗糖浓度12%的培养基产生的根状茎，在土壤中的发芽率最高；此外，生姜试管苗生根后移栽成活率较低，这可能与组培苗直接利用培养基中的碳源，自养能力较弱有关。但是，在生姜组织培养生根阶段，转接到含谷氨酸的无糖培养基中培养，可以大大提高移栽成活率[25-26]。因此，在生姜组织培养的各个阶段，对蔗糖浓度进行调整，以达到最佳的效果很有必要。5生长调节物质基本培养基能保证培养物的生存与最低生理活动，但只有配合使用适当的外源生长调节物质才能诱导细胞分裂的启动、愈伤组织生长及根、芽的分化等合乎理想的变化。植物组织培养中，影响培养力的因素是多方面的，而外源生长调节物质是愈伤组织诱导和绿苗分化的关键因素。常用于生姜组织培养的生长调节物质有三大类：生长素类（吲哚乙酸IAA、萘乙酸NAA、2，4-D、吲哚丁酸IBA等）、细胞分裂素类（6-苄基腺嘌呤6-BA、玉米素ZT和激动素KT等）和生长抑制剂。这三类激素在生姜组织培养的各个阶段，所需的种类及浓度是不同的。单独添加生长素或者细胞分裂素的诱导效应都不明显，两者同时使用具有相-5-互增益效应。研究表明，生姜芽的诱导和增殖需要高浓度的细胞分裂素和低浓度生长素配合。罗天宽等[27]报道，将台湾大肉姜的茎尖接种在MS+6-BA5mg/L+NAA0.5mg/L培养基上，出芽率最高，在继代培养基MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L中其繁殖系数能达到6.8倍/28d；唐燕梅[17]使用MS+6-BA3.0mg/L+NAA1.0mg/L作为初代培养基诱导出芽，继代增殖培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L，然后使用1/2MS+NAA0.1mg/L的培养基诱导生根，达到了很好的效果；刘小阳[14]的研究表明初代培养基使用MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L，增殖培养基使用MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L，而壮苗诱导生根使用1/2MS+6-BA0.15mg/L+NAA0.1mg/L效果最佳；生姜增殖与生根诱导可以同时进行，雷开荣[28]以MS+6-BA3.0mg/L+NAA1.0mg/L培养基同时进行生姜增殖与生根诱导，继代繁殖周期为25-30d，繁殖系数7以上，生根诱导率达100%。张耀华[23]报道6-BA对鲁大姜茎尖增殖系数为3.83，效果较优于KT,其最适浓度为2.0mg/L，