凝固酶阴性葡萄球菌.

凝固酶阴性葡萄球菌致病性分子标志物的建立与应用姜美娟中国人民解放军第401医院11、立题依据凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）广泛存在于人体皮肤、黏膜等组织表面，常在血液、痰液、尿液、深静脉置管等各种标本中检出。文献报道，1995-1996年美国48个医学中心2596份血标本中，CoNS的分离率达32.2%。尽管血液等无菌体液培养出CoNS临床意义较大，但据报道单次血培养CoNS污染的可能性仍高达85%。第一部分研究背景和意义2近年来由于介入性诊疗操作、免疫抑制剂及广谱抗生素的广泛使用，CoNS已成为院内感染的重要病原菌，而且耐药菌株比金黄色葡萄球菌更为多见。叶联华等报道人工瓣膜术后心内膜炎中，约有40%-50%由凝固酶阴性葡萄球菌引起；2009年中国CHINET细菌耐药监测结果MRCoNS检出率平均为71.7%,大于MRSA的52.7%。研究背景和意义3CoNS作为皮肤黏膜定植菌，在越来越多的标本中被分离出来，常常引起临床困惑。其是否能作为感染的病原菌是临床关心的问题。有鉴于此，实验室建立对CoNS污染菌和致病菌界定的方法十分必要，是临床明确诊断和制定合理治疗方案的重要前提。研究背景和意义4CoNS致病物质在CoNS感染的发病过程中，细菌先黏附继而形成难以清除的生物膜是其最为重要的致病机制；其中CoNS产生的多糖胞间黏附素（polysacchatideintercellularadhesion，PIA）是细菌生物膜形成聚集阶段所必需的物质，在感染过程中起重要的作用，是鉴定其致病性的物质基础。Heilmann等发现ica操纵子对合成PIA以及在细菌形成成熟的生物膜中起到非常重要的作用。研究背景和意义5ica基因结构ica基因座定位于细菌染色体，全长3.4kb，包括icaR调节基因及串联存在的icaA、icaD、icaB和icaC结构基因。其中，icaADBC4个基因构成一个操纵子，可以通过检测icaADBC基因来反映ica操纵子的存在。icaB不直接参与胞间黏附素的合成,因为重组icaADC就能使细胞积聚；icaA单独呈现低的N-乙酰葡糖胺转移酶活性；icaC涉及到把不断合成的多糖物质转运至细胞表面；生物膜的形成要求icaD编码的产物具有最佳活性。因此,我们选择了icaD作为本试验的目的基因片段。研究背景和意义6获得CoNS特异的致病性分子标志物；确立敏感、准确、快速的医院感染相关性CoNS特异基因诊断方法；能够准确鉴定致病性与非致病性CoNS。研究背景和意义2、实验目的7研究CoNS的生物标志物对该菌在医院获得性感染中的临床微生物学诊断与鉴定，追踪传染源，探索其在医院感染中的确切作用和地位、传播与感染规律，从而对控制传播途径、建立准确有效的防治措施具有重要实际意义和经济价值。研究背景和意义3、临床意义8阴性对照：表皮葡萄球菌ATCC12228，购自中国药品鉴定所，经基因组测序证明其ica操纵子缺失；阳性对照：表皮葡萄球菌1-97-337，瑞金医院倪语星教授惠赠，含有完整ica操纵子；待测样本：自2006年1月至2007年9月，收集我院临床各科室共114例疑是感染性标本。第二部分材料和方法1、研究对象92、主要试剂培养基：哥伦比亚琼脂培养基、刚果红琼脂培养基、LB肉汤增菌液。引物：SodA引物（5‘-CCITAYICITAYGAYGCIYTIGARCC-3’及5‘-ARRTARTAIGCRTGYTCCCAIACRTC-3’）；icaD引物（5‘-AGGCAATATCCAACGGTAA-3’及5‘-GTCACGACCTTTCTTATATT-3’）；16SrDNA引物（5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’及5‘-CCGTCAATTCCATTTRAGTTT-3’）。材料和方法103、主要仪器设备PCR仪：PTC100PCR仪，美国MJResearchInc.；恒压恒流电泳仪、电泳槽：DF-C型，北京东方特力科贸中心；凝胶成像系统：GDS8000，美国UVPInc.；核酸/蛋白定量仪：DU640，美国Beckman；酶标仪：美国雷杜，深圳组装；ATBExpression：法国bioMérieuxInc；生物安全柜：BSC-1500ⅡB2，济南鑫贝西生物技术有限公司；全自动快速微生物培养检测系统：BacT/ALERT3D60，法国bioMérieuxInc；材料和方法114、实验设计及方法标本采集阴、阳性对照菌种鉴定PIA检测PCR扩增icaD基因sodA基因16SrDNA序列生物膜形成实验DNA测序、生物信息学分析确定特征片段临床验证比较分析材料和方法12图2.1：部分样品刚果红试验结果41、刚果红试验第三部分结果和讨论13表2.1:114例CoNS的菌种组成及刚果红试验结果菌种例数所占比例（％）刚果红试验阳性刚果红试验各菌种阳性率（％）表皮葡萄球菌4741.21838.3溶血葡萄球菌4337.736.98人葡萄球菌119.6519.09木糖葡萄球菌32.630－沃氏葡萄球菌21.750－头状葡萄球菌32.63133.3中间葡萄球菌10.861100山羊葡萄球菌21.750－缓慢葡萄球菌合计21141.75100024－结果和讨论14刚果红试验通过培养48h后菌落的颜色变化来反映CoNS表达多糖胞间黏附素的情况，进而间接地反映其致病性。114例样品中刚果红试验阳性率21.1%，由于CoNS分泌的PIA在培养过程中可以丢失，使阳性结果偏低；另外，其方法学本身易于受多种因素影响，比如：蔗糖的浓度、氯化钠和琼脂的浓度、气体条件等，干扰了实验结果的正确性，不能满足临床要求。结果和讨论152、icaD基因片段的扩增abcdefg20001000500250(bp)图2.2：部分样品的icaD基因片段的PCR扩增结果结果和讨论16表2.2:114例CoNS不同菌种icaD片段PCR扩增的结果菌种例数所占比例（％）icaD片段PCR阳性结果PCR实验各菌种阳性率（％）表皮葡萄球菌4741.22042.6溶血葡萄球菌4337.7818.6人葡萄球菌119.65218.2木糖葡萄球菌32.630－沃氏葡萄球菌21.750－头状葡萄球菌32.6266.7中间葡萄球菌10.861100山羊葡萄球菌21.750－缓慢葡萄球菌合计21141.75100033－结果和讨论17结果和讨论18图2.3:部分样品的定性黏附性实验结果3、体外黏附性实验结果和讨论19表2.4:9例icaD（+）菌株半定量黏附性实验结果实验分类实验例数黏附实验阳性黏附实验阴性icaDPCR（＋），刚果红（＋）660icaDPCR（＋），刚果红（—）321合计981结果和讨论20通过体外半定量黏附实验测得88.9%（8/9）icaD（+）菌株是粘附株。可见以半定量黏附试验结果作为生物膜形成能力的判定标准，ica操纵子的存在与CoNS粘附及其生物膜形成密切相关。体外黏附性实验用光吸收原理检测生物膜成分，但生物膜本身的结构会受到破坏；且由于方法比较复杂，需要严格控制实验条件才能获得较好的重复性，不适合临床常规应用。结果和讨论214、16SrDNA及sodA基因片段扩增abcde20001000500100(bp)图2.5：部分样品的16SrDNA片段PCR扩增结果结果和讨论22图2.6：部分样品的sodA片段PCR扩增结果abcde20001000500250(bp)结果和讨论23图7：部分样品sodAPCR扩增产物的测序图谱结果和讨论2437例CoNS样品进行了16SrDNA基因及sodA基因片段的PCR扩增，电泳检测结果显示全部样品均能准确地扩增出相应的片段，其片段大小分别为16SrDNA926bp及sodA482bp，且均为单一条带；序列测定表明所有样品16SrDNA及sodAPCR产物序列均相同，未发现与感染相关的特异性分子序列。结果和讨论25ica操纵子可出现在多种CoNS中，临床实验室建立并常规进行CoNS致病性分子标志物的检测方法是有意义、有必要的；通过本实验我们确立了的敏感、准确、快速的医院感染相关性CoNS基因诊断新方法，即icaD基因扩增方法；第四部分结论26结论本研究首次报道了除表皮葡萄球菌以外的其他种的凝固酶阴性葡萄球菌产生多糖胞间粘附因子的情况；表皮葡萄球菌在临床CoNS中检出最多，是携带icaD操纵子的主要菌种，其致病性应引起足够重视；27结论16SrDNA以及sodA基因可作为鉴定CoNS的基因标记，但不能用来作为致病性与非致病性凝固酶阴性葡萄球菌的鉴别依据。目前区分致病性与非致病性凝固酶阴性葡萄球菌的基因标志仍是串联存在的icaD基因片段，其可被认为是获得性医院感染相关性CoNS特异的基因型或基因标志物。2829