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《医学免疫学》课程实验教案实验一实验名称：E-玫瑰花环形成实验计划学时：4学时实验目的与要求：1.掌握人T淋巴细胞形成E-花环的实验原理和操作方法。2.熟悉T淋巴细胞的功能检测方法。实验仪器、试剂：淋巴细胞分层液（Ficou）、1%绵羊红细胞、肝素抗凝人血、无钙镁Hanks液、水平离心机、0.8%戊二醛、37℃水浴箱、显微镜、其他。实验对象：实验同学实验原理：体外测定人外周血中T淋巴细胞数量的方法有多种,以玫瑰花环试验最为简易常用，T淋巴细胞数量的变化与机体的细胞免疫功能状态有一定关系。人周围血液中T淋巴细胞表面有绵羊红细胞受体，与绵羊红细胞相遇时，在其周围形成花环样细胞团，凡能结合三个以上绵羊红细胞者称为E攻瑰花环形成细胞。正常人的花环形成率为50~70%，大致可以代表周围血中T细胞的百分数。临床上多用于某些疾病的诊断及疗效的观察。操作方法：1、取肝素抗凝血1~2ml，用分层液分出淋巴细胞并洗涤，用Hanks液调整细胞浓度为2—2.5×106ml。2、取小试管加入lml淋巴细胞悬液及1%羊红细胞0.lml，混匀置37℃水浴箱5分钟。3、800～1000r/min低速离心5分钟，放4℃冰箱2小时。4、轻轻旋转试管使团块混匀，加2滴0.8%戊二醛液，摇匀，室温静置10分钟，使E花环固定。5、取悬液一滴放于载玻片上，将稀释的瑞氏染液加入玻片上染色3分钟。6、弃去染液，待干后油镜观察，计数200个淋巴细胞中形成花环的细胞效，算出百分率。实验现象与数据：1、淋巴细胞染成深蓝色，羊红细胞染成淡红色。2、每个淋巴细胞上粘附三个以上羊红细胞者即为玫瑰花环形成细胞。结果分析与结论：共计200个T淋巴细胞，算出形成花环细胞占全细胞数的百分率。正常人的花环形成率为50~70%，大致可以代表周围血中T细胞的百分数。临床上多用于某些疾病的诊断及疗效的观察。注意事项：1.离心时注意使用800～1000r/min低速离心。2.要轻轻旋转试管使团块混匀，以防形成的花环散开。思考与创新：实验二实验名称：淋巴细胞转化实验计划学时：实验目的与要求：1.掌握淋巴细胞转化现象的试验方法和原理。2.熟悉淋巴母细胞形态学观察方法。实验仪器、试剂：1、正常人淋巴细胞（用分层液分出）。2、培养液：0.5%水解乳蛋白Hanks氏液（含20%小牛血清和青霉素100单位/ml、链霉素100微克/ml）。用5.6%NaHCO3调整PH至7.2~7.4。3、植物血凝素(PHA)，姬姆萨染液。4、青霉素小瓶、吸管、载玻片、显微镜、离心机、恒温箱等。实验对象：实验同学实验原理：T淋巴细胞受到特异性抗原或非特异性抗原（PHA、PWM和ConA）刺激均能使细胞发生转化。T淋巴细胞转化率的高低可反映人体细胞免疫功能水平，常被作为细胞免疫功能指标之一。淋巴细胞转化试验可从周围血中分离出淋巴细胞，也可采用全血试验。操作方法：1、制备细胞悬液：用培养液将淋巴细胞稀释成2×l06/ml，细胞悬液。2、分装：向两个小瓶中各加2ml，细胞悬液,一瓶加PHA0.1ml(100单位)，另瓶不加作对照。3、37℃培养72小时。离心沉淀，用Hanks液洗两次。4、用沉淀推成血片,加姬姆萨染液栗色,镜下观察计数200个以上淋巴细胞，算出转化率。实验现象与数据：1、成热的淋巴细胞:与外周血中小淋巴细胞形态一致、直径6~8微米，核染色质网密、无核仁、胞浆略大于核贡轻度嗜碱性。2、过度型淋巴细胞:直径10一20微米核质密，但有明显核仁。3、淋巴母细胞，细胞增大，形态不规则，直径20~30微米，核也增大，染色质网纤细有核仁1~2个，胞浆扩大，强嗜碱性可见数个空泡及颗粒。4、网状细胞样母细胞：细胞增，形态不规则，核淡染有1一2个大小不规则的核仁，胞浆扩大、含空泡，嗜碱性不强有透明感。用姬姆萨染色后，计算200个淋巴细胞中转化为母细胞的细胞数（包括过渡型、母细胞和分裂相淋巴细胞），依转比的百分率判定T淋巴细胞的功能。结果分析与结论：对照管转化率1%左右，加PHA之管转化主约为70%左右。T淋巴细胞转化率的高低可反映人体细胞免疫功能水平，常被作为细胞免疫功能指标之一。注意事项：思考与创新：实验三实验名称：中性粒细胞吞噬功能测定计划学时：4学时实验目的与要求：1、掌握中性粒细胞吞噬白色葡萄球菌实验的操作过程2、掌握瑞氏染色的基本步骤及吞噬百分率的计算实验仪器、试剂：葡萄球菌培养液抗凝剂载玻片瑞氏染液水浴箱离心机注射器止血带消毒药水实验对象：实验同学实验原理：中性粒细胞具有非特异性的吞噬功能。操作方法：1.采血：取人静脉血2毫升，放入含肝素的小试管中，混匀，防止凝血。2.菌液制备：取葡萄球菌液，加生理盐水离心洗涤2～3次(2000r/min,5～10min），去上清，留沉淀加入生理盐水，用比浊法配制到适宜浓度（1×107个/ml）。3.混合温浴：将制备好的菌液0.5毫升加入到抗凝的人静脉血中轻轻混匀，置于37℃水浴箱中水浴30分钟（每10分钟轻摇匀一次）。4.吸取混合悬液点在玻片上，制成血涂片，干燥后进行瑞氏染色，油镜下观察。实验现象与数据：镜下可见中性粒细胞细胞核呈蓝色，被吞噬的葡萄球菌呈蓝（紫）色，计数200个中性粒细胞，并计算吞噬阳性细胞的百分率。结果分析与结论：吞噬率＝吞噬细菌中性粒细胞/200个中性粒细胞×100%注意事项：1.菌液配备时注意无菌操作。2.注意静脉血和菌液应按一定体积比混合，血﹕菌=5﹕1思考与创新：实验四实验名称：凝集反应计划学时：实验目的与要求：1、掌握抗原抗体反应的特异性。2、熟悉凝集反应的原理、方法和分类。实验仪器、试剂：1、妊娠诊断血清(抗——HCG血清)。2、妊娠诊断抗原(吸附有HCG的免疫微球)。3、待检尿、正常尿、生理盐水、吸管、试管、玻片等。实验原理：凝集反应是完整的细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体在一定条件下出现凝集物的现象。参与反应的抗原称凝集原，抗体称凝集素。凝集反应包括直接凝集反应、间接凝集反应、间接凝集抑制反应、反向间接凝集反应、协同凝集试验、抗球蛋白试验等。本实验介绍间接凝集抑制反应。可溶性抗原与抗体结合后不出现凝集。如把可溶性抗原吸附在载体微球上，成为人工免疫微球，再与抗体结合即出现凝集，此称间接凝集反应。由于载体微球增大了可溶性抗原的反应面积，微球上少量抗原存在就足以出现肉眼可见的反应。这种反应的敏感性比沉淀反应高得多。如先使可溶性抗原与抗体充分结合，再加入有关的免疫微球。因抗体已被抗原结合，不再出现免疫微球的凝集现象。这一试验称间接凝集抑制反应。绒毛膜促性腺激素(HCG)为可溶性抗原，在妊娠尿中含量显著增高。如尿中有此抗原存在与相应抗体(抗一HCG)结合后，加入吸附HCG的免疫微球时，不出现凝集现象，呈均匀乳液，如尿中无HCG存在，没有抗原与抗体结合，再加入相应的免疫微球时，即出现肉眼可见的凝集(即凝集未被抑制)。操作方法：1、取一洁净玻片，用蜡笔划分1、2两格。(图1)待检尿正常尿1、阳性结果2、阴性结果2、加被检尿滴于1格内，加正常尿滴于2格内。3、每滴尿中各加抗——HCG血清1滴摇匀或用牙签混匀。4、再于各滴中加（HCG乳胶抗原。HCG兔疫微球）1滴；混匀，继续摇动2～3分钟，肉眼观察结果。实验现象与数据：妊娠尿滴呈均匀乳状，无凝集现象(阳性)。正常尿滴出现明显凝集颗粒(阴性)。结果分析与数据：思考与创新：实验八实验名称：沉淀反应计划学时：实验目的与要求：1、掌握抗原抗体反应的特异性和沉淀反应的原理。2、熟悉双向琼脂扩散、单向琼脂扩散的操作方法和结果分析。实验仪器、试剂：（一）双向琼脂扩散试验：1、抗体：甲胎蛋白诊断血清。2、抗原:肝癌病人甲胎蛋白阳性血清或正常人胚胎组织浸出液，待检血清。3、1%生理盐水琼脂、载玻片、打孔器、毛细管等。（二）单向琼脂扩散试验：1、3%生理盐水琼脂。2、抗体:免抗人毛Ig抗体血清。3、抗原:待检人血清、IgG参考抗原。4、塑料板、吸管、打孔器。实验对象：实验同学实验原理：（一）双向琼脂扩散试验利用可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂对应孔中各自向四周进行扩散，如抗原抗体相对应，两者在比例适当处，就出现肉眼可见的白色沉淀线。若同时具有几种抗原抗体系统，因各自的扩散速度不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。（二）单向琼脂扩散试验单扩散实验是一种定量试验方法。先将一定量抗体混合于琼脂中，倾注于平板上。凝固后打孔。加入待测抗原。如抗原与抗体一致时，抗原向孔四周扩散，与孔周围抗体形成抗原抗体复合物，呈白色沉淀环，沉淀环直径大小与抗原浓度成正比。如先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量，即可从标准曲线中求出。本试验主要用于检查标本中各种Ig与血清中各种补体成分的测定。操作方法（一）双向琼脂扩散试验1、将1%生理盐水琼脂加热溶化。2、制备琼脂板:取洁净载片一片，放一水平台上，将溶化的2·5m1琼脂趁热用吸管注于玻片上，使其自然流成平面，琼脂凝固后用打孔器打孔，去掉孔中的琼脂。3、加样:中央孔中加入甲胎蛋白（AFP）诊断血清，1、4孔加肝癌病人阳性血清，2、3、5、6孔加待检血清。加血清至满勿外溢。不可有气泡。4、加样后，将掠脂板放入有一定湿度带盖容器中，置37℃温箱，24小时观察结果。（二）单向琼脂扩散试验1、制备含抗IgG抗体的琼脂板:溶化的3%琼脂、待冷至56℃时吸取1.5ml琼脂与等量适当稀释的抗IgG抗体混合均匀。倾注于水平放置的塑料板上，制成厚薄均匀的琼脂板。凝固后用打孔器打孔二排，每排5孔、孔距8—10mm，孔要圆整光滑。图示单向琼脂扩散试验模式2、加样:用微量加样器加样。(1)第一排五孔分别加入不同浓度(20、25、50、100、200倍)的参考IgG抗原10μl。(2)第二排五孔，同法加1:50待检血清10μl，3将琼脂板平放于保持一定湿度的带盖容器内，37℃温箱放置24小时观察结果。实验现象与数据：结果分析与结论：（一）双向琼脂扩散试验1、1、4孔为阳性对照孔(加已知阳性标本)，与中央孔间出现乳白色沉淀线。2、其余各孔与中央孔如出现沉淀线，且一端与阳性对照沉淀线相吻合者为阳性。证明该份血清含有甲胎蛋白。如两条沉淀线相交，表明二者抗原性不同，出现的沉淀线另一种抗原抗体反应，不能判定阳性。3、如待检孔与中央抗体孔间未出现沉淀线为阳性，证明待检血清中没有甲胎蛋白。图示双向琼脂扩散试验结果2、6孔：吻合沉淀线（阳性）。5孔：交叉沉淀线（阴性）。3孔：无沉淀线（阴性）。（二）单向琼脂扩散试验标准曲线的绘制及血清标本中IgG含量的测定。1、以各稀释度标准抗原孔沉淀环直径为横座标，相应孔中IgG含量为纵座标在半对数座标纸上作图，画出标准曲线。2、依待检血清标本孔沉淀直径，查标准曲线，将查得的唾G含量乘以标本的稀释倍数，即为血清中IgG的含量。注意事项：思考与创新：实验九实验名称：巨噬细胞吞噬功能试验计划学时：实验目的与要求：1、掌握巨噬细胞的生物学功能。2、熟悉巨噬细胞吞噬功能试验的原理和操作方法。实验仪器、试剂：1、1%鸡红细胞悬液、瑞氏染液。2、6%可溶性淀粉肉汤肉汤培养液100ml加入可溶性淀粉6g，混匀后煮沸灭菌备用。。3、解剖小器械一套、无菌注射器、显微镜。实验动物：小白鼠实验原理:巨噬细胞具有吞噬大颗粒异物的特性，通常选用鸡红细胞作为吞噬颗粒，将其注入小鼠腹腔中，腹腔中巨噬细胞则将鸡红细胞吞入。取小鼠腹腔液涂片、染色后可见鸡红细胞被吞噬的现象，计数100个吞噬细胞中吞噬鸡红细胞的细胞数可判断其吞噬功能。操作方法：1、于验前3天，小白鼠腹腔内注射6%可溶性淀粉肉汤1ml。2、试验当天于每只小鼠腹腔内注射0.5ml1%鸡红细胞悬液，并轻揉腹部。3、注射后30min，将小鼠处死、取腹腔液涂片并行瑞氏染色。4、油镜观察涂片。实验现象与数据：镜下可见吞噬细胞细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞胞浆呈红色，而核则然成蓝色（鸡红细胞有细胞核）。计数100个吞噬细胞，并计算吞噬阳性细胞的百分率。结果分析与结论：吞噬率＝(吞噬鸡红细胞阳性细胞/100个巨噬细胞)×100%吞噬率与试验前腹腔刺激产生吞噬细胞、吞噬的时间等有关。注