几种无机离子对黄孢原毛平革菌的酶活性影响分析

1几种无机离子对黄孢原毛平革菌的酶活性影响分析陈英，杨伟球，邱学林，林惠菲（苏州农业职业技术学院生态环境系，江苏苏州，215008）摘要：以黄孢原毛平革菌为代表的白腐真菌，其分泌的木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）等酶系能降解木质素以及前体类似物。本研究对几种无机金属离子、无机阴离子对黄孢原毛平革菌所产酶系中的木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）的酶活性影响进行了比对分析。结果表明，Fe3+对木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）都有很强的抑制作用，Fe2+、Ca2+对木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）表现出不同的促进作用，Br-比Cl-的激活作用稍弱。关键词：黄孢原毛平革菌；木质素过氧化物酶；锰过氧化物酶；酶活TheImpactofInorganicIonsonEnzymaticActivityofPhanerochaetechrysosporiumChenYing，YangWei-qiu，QiuXue-lin，LinHui-fei（SuzhouPolytechnicInstituteofAgriculture,SuzhouJiangsu215008）Abstract：AstherepresentativeofWhite-rotFungus,PhanerochaetechrysosporiumcansecreteLigninperoxidesandManganeseperoxidesandsoon,whichcandepredateLigninandPrecursoranalogs.ThroughusingInorganicionsandOrganicmoleculesasActivator，Enzymeactivityindifferentconditionswasresearched.TheresultsshowthatFe3+onLiPandMnPhadstronginhibitoryeffect,butFe2+andCa2+onthoseshoweddifferentpromotingeffect,AndBr-thanCl-activationinvitromp,EDTAisliftingofheavymetalionsonenzymeinhibition.Keyword：Phanerochaetechrysosporium，LigninPeroxides，Manganeseperoxides，Enzymaticactivity木质素广泛存在于植物细胞中，是自然界中含量最多的有机可再生资源。在植物体内，木质素通过化学键和半纤维素连接，然后包裹在纤维素外，形成木质纤维素。木质素由于具有各种生物学稳定的复杂键型而不易被微生物降解。要解决如何高效利用木质纤维素这一问题，关键在于如何降解包裹在纤维素晶体外面的木质素以及半纤维素，从而增加纤维素表面积，使纤维素易于降解和利用[1]。随着人类可利用资源的越来越紧缺,木质素的微生物降解成了当今研究的热点。白腐真菌作为已知的唯一可独立降解木质素的微生物，其能分泌木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）和漆酶（Laccase）等酶降系统[2]。在黄孢原毛平革菌的整个生长阶段，木质素过氧化物酶（LiP）的合成量要比锰过氧化物酶（MnP）大得多，它基金项目：苏州农业职业技术学院2012年度科研创新团队建设项目（ITM201205）作者简介：陈英（1979-），女，江苏南通人，硕士，讲师，主要从事农业环境保护研究。E-mail：[e-mail]。2在木质素降解中起主要作用。同时，木质素过氧化物酶（LiP）是降解木质素的模型物，因此木质素过氧化物酶（LiP）在木质素降解中起主导作用[3]。而锰过氧化物酶（MnP）是几乎所有的木生白腐菌和各种土壤中的枯叶分解真菌所产生的，是最为普遍的木质素修饰过氧化物酶[4]。本文对几种无机金属离子、无机阴离子对黄孢原毛平革菌所产酶系中的木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）的酶活性影响进行研究，以期通过比对分析，来为这两种酶的大规模应用提供一定的参考数据。1材料与试验方法1.1试验材料1.1.1菌种选用白腐真菌中的黄孢原毛平革菌为研究对象。1.1.2培养基（1）固体PDA培养基土豆浸出液200g，葡萄糖20g，琼脂20g。（2）液体培养基葡萄糖（碳源）10g/L、酒石酸铵（氮源）1.2mmol/L、醋酸-醋酸钠缓冲液0.2mol/L、KH2PO42.0g/L、CaCl20.130g/L、MgSO4·7H2O1.5g/L、吐温-800.5g/L、VA0.4mmol/L以及微量元素混合液10mL。（3）微量元素混合液MnSO42.9mmol/L、CaCl21.0mmol/L、NaCl0.15mmol/L、NaBr0.15mmol/L、ZnCl20.345mmol/L、FeSO40.358mmol/L、CuSO40.4mmol/L、CoCl2·6H200.458mmol/L、KAl（SO4）2·12H2O0.022mmol/L、HBO30.16mmol/L、NaMoO4·2H2O0.042mmol/L。1.1.3主要仪器设备752型紫外-可见分光光度计，SPX-250B-Z型生化培养箱，YXQ-LS-50S立式压力蒸汽灭菌器，SHZ型水浴恒温振荡器。1.2试验方法1.2.1粗酶液的制备将黄孢原毛平革菌接种在固体PDA培养基上，置于30℃恒温培养箱中培养。待菌种长满整个平板后取8mm菌塞，250mL摇装入液体培养基100mL，接入菌塞2个。30℃、120r/min恒温振荡培养。选取黄孢原毛平革菌第8d的培养液经4000r/min、15min离心后取上清液作为粗酶液。1.2.2酶活测定木质素过氧化物酶（LiP）：50mmol/L的酒石酸-酒石酸钠缓冲液（pH值约2.5）、去离子水、2mmol/L的3蔾芦醇、4mmol/LH2O2以及一定量的粗酶液，用紫外-可见分光光度计检测310nm处在2.5min内吸光值变化；定义氧化1µmol/min蔾芦醇成蔾芦醛所需的酶量为1个酶活力单位。锰过氧化物酶（MnP）：50mmol/L的酒石酸-酒石酸钠缓冲液（pH值约5）、1.6mmol/LH2O2、6mmol/LMnSO4以及一定量的粗酶液，用紫外-可见分光光度计检测310nm处在4min内吸光值变化；定义氧化1µmol/minMn2+为Mn3+所需的酶量为1个酶活力单位。木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）的性质测定方面，分别选择Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+、Ag+等金属离子，以及阴离子NO3-、Cl-、Br-作为效应物，在酶活力测试体系中，加入不同浓度的效应物，测定酶的相对活力。2结果与分析2.1不同金属离子对酶活性的影响向反应体系中加入浓度为50mmol/L金属离子溶液，使反应体系最终金属离子浓度为5mmol/L，预热至37℃，加入1.6mmol/L的H2O2溶液0.1mL启动反应，测定反应最初3分钟内λ=240nm处吸光度变化。其余相同温度、pH条件下测定酶活[5]。结果如图1、2所示。图1不同金属离子浓度与LiP酶活力关系图（注：1——Na+，2——K+，3——Mg2+，4——Zn2+，5——Fe2+，6——Fe3+，7——Ca2+,8——Cu2+，9——Ag+）由图1可知，随着Ca2+浓度的增加，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力增加，这说明Ca2+对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活有一定促进作用。而随着Na+浓度的增加，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力减小，这说明Na+对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活有一定抑制作用。而随着K+和Mg2+浓度的增加，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力变化不明显。Zn2+只有在浓度达到24mmol/L才表现出明显的促进作用，随之到达28mmol/L,又迅速降到原来水平。而随着Fe2+浓度从4mmol/L增加到24mmol/L，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力由慢而快地增大，超过12mmol/L，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力又由快到慢地降到原来水平。这说明Fe2+浓度为12mmol/L时，酶活力最高。Fe3+则是随着浓度的增加，到28mmol/L时，木质素过氧020406080100120140160180481216202428浓度Concentration（mmol/L)123456789酶活力Enzymeactivity（%）4化物酶（LiP）的酶活力降到近乎丧失了酶活力，这说明Fe3+对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活有一定抑制作用。在4～8mmol/L时，随着Cu2+浓度的增加，酶活也增加；当Cu2+浓度为8mmol/L时，酶活最高；8mmol/L之后，酶活随着Cu2+浓度的增加而降低。而Ag+浓度几乎不影响木质素过氧化物酶（LiP）的酶活性。图2不同金属离子浓度与MnP酶活力关系图（注：1——Na+，2——K+，3——Mg2+，4——Zn2+，5——Fe2+，6——Fe3+，7——Ca2+,8——Cu2+，9——Ag+）由图2可知，在同样条件下，锰过氧化物酶（MnP）的酶活力也随金属离子浓度改变而异。随着Ca2+浓度的增加，锰过氧化物酶（MnP）的酶活力逐渐增加，这说明Ca2+对锰过氧化物酶（MnP）的酶活也有一定促进作用。而随着Na+浓度的增加，锰过氧化物酶（MnP）的酶活力减小，这说明Na+对锰过氧化物酶（MnP）的酶活也有一定抑制作用。而随着K+和Mg2+浓度的增加，锰过氧化物酶（MnP）的酶活力也变化不明显。Zn2+只有在浓度达到24mmol/L才表现出明显的促进作用，随之到达28mmol/L,又迅速降到原来水平。这点与对木质素过氧化物酶（LiP）的作用类似。但是，较对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活影响有所不同的是，Fe2+始终对锰过氧化物酶的酶活起促进作用，而且锰过氧化物酶（MnP）的酶活力与浓度成正比。Fe3+对锰过氧化物酶（MnP）的酶活也有一定抑制作用，而且锰过氧化物酶（MnP）的酶活力与Fe3+浓度成反比。在4～8mmol/L时，随着Cu2+浓度的增加，酶活也增加，当Cu2+浓度为8mmol/L时，酶活最高；8mmol/L之后，酶活随着Cu2+浓度的增加而降低，这与对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活影响比较分析，其结果近乎类似。而Ag+浓度也几乎不影响锰过氧化物酶（MnP）的酶活力。2.2阴离子对酶活性的影响向反应体系中加入浓度为50mmol/L阴离子表面活性剂，使反应体系最终阴离子浓度为5mmol/L，预热至37℃，加入1.6mmol/L的H2O2溶液0.1mL启动反应，测定反应最初3分钟内λ=240nm处吸光度变化。其余相同温度、pH条件下测定酶活[6]。结果如图3所示。020406080100120140160180481216202428浓度Concentration（mmol/L）酶活力Enzymeactivity（%）1234567895图3不同阴离子浓度与LiP酶活力关系图（注：1——Cl-，2——Br-，3——NO3-）由图3可知，阴离子表面活性剂对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力有明显的影响。在15～30mmol/L时，随着Br-和Cl-浓度的增加，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力升高，这说明Br-和Cl-对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活有一定促进作用。在30～105mmol/L时，随着Br-和Cl-浓度的增加，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力降低，酶活力与浓度关系成反比，这说明Br-和Cl-对木质素过氧化物酶（LiP）的酶活有一定抑制作用。结果表明，当30mmol/L时，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力达到最大。但是，对其作用方向是激活或是抑制尚无一个统一的结果，只是Br-比Cl-的激活作用稍弱。而随着NO3-浓度的增加，木质素过氧化物酶（LiP）的酶活力变化不明显。3结论（1）经过木质素过氧化物酶