分光光度技术3-4.

第二章分光光度技术分光光度技术分光光度技术(分光光度法)主要是指利用物质特有的光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是Lambert和Beer定律。分光光度法是比色法的发展:比色法只限于在可见光区，分光光度法则可以扩展到紫外光区和红外光区。比色法用的单色光是来自滤光片，谱带宽度从40－120nm，精度不高，分光光度法则要求近于真正单色光，其光谱带宽最大不超过3－5nm，在紫外区可到1nm以下，来自棱镜或光栅，具有较高的精度。分光光度技术基本原理分光光度计基本结构简介分光光度技术的基本应用分光光度法的误差分光光度技术基本原理一、光的基本知识光是由光量子组成的，具有二重性，即不连续的微粒性和连续的波动性。波长和频率是光的波动性的特征，可用下式表示：Ｃλ＝───Ｖ式中λ为波长，具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长。Ｖ为频率，即每秒钟振动次数。Ｃ为光速等于299770千米／秒。光属于电磁波。自然界中存在各种不同波长的电磁波，分光光度法所使用的光谱范围在200nm-10μ（1μ=1,000nm）之间。其中200nm－400nm为紫外光区，400nm－760nm为可见光区，760nm－10,000nm为红外光区。自然界的电磁波谱自然界的电磁波谱①γ射线(γ-ray)它是放射性物质发出的电磁波,波长在2×10-10m以下。是一种能量很大的光子流。在医疗上用γ射线作为“手术刀”来切除肿瘤,叫做γ刀,有很好的治疗效果。②X射线(X-ray)它是由X射线管产生的电磁波，波长在10-15~10-7m，X射线对不同密度的物质有不同的穿透力。在医学上常用作医疗检查。在飞机场安全检查中，也常用X射线对行李进行透视查验。自然界的电磁波谱③紫外线(ultravioletray)当光电流通过两电极间的电离气体时，会产生紫外线。其波长在4×10-8~4×10-7m。太阳光中含有紫外线。紫外线能激发荧光，日光灯就是管内紫外线激发涂在灯管内壁上的荧光粉而发出的近似日光光谱的照明灯。紫外线也常用在医学上杀菌和防伪技术上。自然界的电磁波谱④可见光(visiblelight)它是能引起人的视觉感觉的电磁波，其波长范围是0.4×10-6~0.8×10-6m。太阳能发出可见光。可见光是由不同比例的七色光(红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫)所混合组成。⑤红外线(infraredray)通常情况下由灼热物体发出的电磁波，其波长范围是0.8×10-6~1×10-3m。它们会导致物体温度的升高。红外电磁波在特定的红外敏感胶片上能形成热成像。自然界的电磁波谱⑥微波(microwave)——常用于雷达设备上的波长很短的无线电波，其波长范围在1×10-3~1m。由于微波的定向性好，常用发射、反射波的时间来测算目标的位置。微波炉是一种用微波的热效应来烹调食品的装置。⑦无线电波(radiowave)它是在电磁场的作用下无线电天线中自由电子发生振荡而产生的电磁波。波长范围在0.75×10-3~1×104m。分光光度技术基本原理朗伯－比尔（Lambert-Beer）定律吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比.A＝－lgT＝KLCA——吸光度，又称光密度“O.D”。T——透光度，T＝I/I。，I。-为照射到吸收池上的光强，I-为透过吸收池的光强。k——摩尔吸光系数（L·mol－1·cm－1）。L——样品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收池，L=1cm。C——样品浓度（mol/L）。由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“k”和物质的浓度“C”成正比。分光光度技术基本原理吸光系数K取决于入射光的波长，溶液的性质和温度等，而与光的强度、溶液的浓度及液层的厚度无关。在一定波长下，它是物质的特性常数。不同物质可能有相同的最大吸收波长，但其吸光系数不一定相同。K值愈大，说明该物质溶液对光吸收愈强烈，则比色测定的灵敏度愈高。分光光度技术基本原理吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性：A＝k1L1C1＋k2L2C2＋k3L3C3＋……即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。分光光度计基本结构简介分光光度计基本结构简介能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器称为分光光度计。分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成，即光源、单色器、狭缝、样品池，检测器系统。基本结构简介----光源光源要求能提供所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度。常用的有白炽灯（钨灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等多种。钨灯和卤钨灯发射320－2000nm连续光谱，最适宜工作范围为360－1000nm，稳定性好，用作可见光分光光度计的光源。氢灯和氘灯能发射150－400nm的紫外结，可用作紫外光区分光光度计的光源。汞灯发射的不是连续光谱，能量绝大部分集中在253.6nm波长外，一般作波长校正用。钨灯在出现灯管发黑时应及更换，如换用的灯型号不同，还需要调节灯座的位置的焦距。氢粘及氘灯的灯管或窗口是石英的，且有固定的发射方向，安装时必须仔细校正接触灯管时应戴手套以防留下污迹。基本结构简介----单色器分光系统（单色器）单色器是指能从混合光波中分解出来所需单一波长光的装置，由棱镜或光栅构成。用玻璃制成的棱镜色散力强，但只能在可见光区工作，石英棱镜工作波长范围为185---4000nm，在紫外区有较好的分辩力而且也适用于可见光区和近红外区。棱镜的特点是波长越短，色散程度越好，越向长波一侧越差。所以用棱镜的分光光度计，其波长刻度在紫外区可达到0.2nm，而在长波段只能达到5nm。有的分光光系统是衍射光栅，即在石英或玻璃的表面上刻划许多平行线，刻线处不透光，于是通过光的干涉和衍射现象，较长的光波偏折的角度大，较短的光波偏折的角度小，因而形成光谱。基本结构简介----狭缝、样品池狭缝狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙，用来调节入射单色光的纯度和强度，也直接影响分辩力。狭缝可在0－2mm宽度内调节，由于棱镜色散力随波长不同而变化，较先进的分光光度计的狭缝宽度可随波长一起调节。比色杯比争杯也叫样品池，吸收器或比色皿，用来盛溶液，各个杯子壁厚度等规格应尽可能完全相等，否则将产生测定误差。玻璃比色杯只适用于可见光区，在紫外区测定时要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的光学面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。基本结构简介----检测系统有许多金属能在光的照射下产生电流，光愈强电流愈大，此即光电效应。因光照射而产生的电流叫做光电流。受光器有两种，一是光电池，二是光电管。光电池的组成种类繁多，最常见的是硒光电池。光电池受光照射产生的电流颇大，可直接用微电流计量出。但是，当连续照射一段时间会产生疲劳现象而使光电流下降，要在暗中放置一些时候才能恢复。因此使用时不宜长期照射，随用随关，以防止光电池因疲劳而产生误差。基本结构简介----检测系统光电管装有一个阴极和一个阳极，阴极是用对光敏感的金属（多为碱土金属的氧化物）做成，当光射到阴极且达到一定能量时，金属原子中电子发射出来。光愈强，光波的振幅愈大，电子放出愈多。电子是带负电的，被吸引到阳极上而产生电流。光电管产生电流很小，需要放大。分光光度计中常用电子倍增光电管，在光照射下所产生的电流比其他光电管要大得多，这就提高了测定的灵敏度。基本结构简介----检测系统检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟的或数字的结果，模拟输出装置包括电流表、电压表、记录器、示波器及与计算机联用等，数字输出则通过模拟／数字转换装置如数字式电压表等。721型可见分光光度计工作波长：340-1000nm721系列可见分光光度计工作波长：340-1000nm721系列可见分光光度计（扫描型）配置：简，操作软件、定量分析、时间扫描，可选配打印机、计算机751型紫外可见分光光度计工作波长：200-1000nm755PC型紫外可见分光光度计标配：操作软件、定量分析、时间扫描、光谱扫描，可选配打印机、计算机UNICO-2102紫外可见分光光度计工作波长：200-1000nm分光光度技术的基本应用测定溶液中物质的含量单一物质的定量分析先测出其吸收光谱曲线，找出最大吸收波长。含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，这样做有两个好处：⑴灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异；⑵可以避免其它物质的干扰。可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。测定标准溶液（浓度已知的溶液）和未知液（浓度待测定的溶液）的吸光度，进行比较，由于所用吸收池的厚度是一样的。也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。分光光度计的应用----定量分析混合样品的定量分析吸收光谱不重叠的混合物定量方法-----互不干扰分别测定吸收光谱重叠的混合物定量方法采用化学计量学方法可以克服光谱定量分析中出现的多重共线性、光谱重叠和组分的相互干扰等问题,并且不需分离可直接同时测定混合体系的各组分。因此发展了如主成分回归(PCR)、小波包变换、人工神经网络(ANN)以及遗传算法等多种线性或非线性的多元校准方法,波长选择是光谱分析中各种多元校准方法的关键步骤。分光光度技术的基本应用定性鉴定用紫外光谱鉴定化合物使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为纵座标绘制吸光度──波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。分光光度技术的基本应用一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中，峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低峰的波长是一定不变的。当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线一样时，则很可能它们是同一物质。紫外线吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。分光光度技术的基本应用结构分析作为结构分析，紫外吸收光谱远不及红外吸收光谱重要可靠，因为紫外吸收光谱曲线的特征性不及红外光谱曲线，红外光谱曲线属‘指纹’型，而大多数有机化合物在紫外光区无吸收。利用紫外吸收光谱可鉴定化合物中具有共轭系统和芳环结构。分光光度技术的基本应用在生化分析领域主要用于氨基酸含量的测定、蛋白质含量的测定、核酸的测定、酶活力测定、生物大分子的鉴定和酶催化反应动力学的研究等。分光光度计的误差浓度过高或过低的样品，易引起检测器标尺上的读数误差。从理论上推算，相对误差最小的部分在透光度为36.8%处（或吸光度为0.4343处），故通常认为测定值在吸光度0.20-0.80范围内（透光度为20%—65%）误差最小，超出此范围，相对误差均会增大。分光光度计的误差影响分光光度计精确度的主要原因还有光谱纯度。一般应保持光谱带宽度在10nm以下，如果测定样品中有很狭窄的吸收峰，就必须有更小的光谱宽度，所以分光光度计均有可调的狭缝。在实际应用中，用较大的狭缝虽然可提高重现性，但加大光谱宽度反而减低了准确度。原则为：在保证测定的情况下，应用较低的狭缝分光光度计的误差散射光也是引起误差的重要因素。散射光指一切未经过测定溶液吸收，而又落到检测器上引起干扰的光，如室内自然光，也包括能透过比色皿的非测定需要的其它波长的光。散射光干扰对高浓度