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实验六凝胶等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点.一实验原理等电聚焦(isoelectricfocusing)又称电聚焦(elcctrofocusing)、聚焦电泳(fousielectrophoresis)等。蛋白质(酶)、多肽等两性电解质，其所带电荷的性质和数量，随所处环境的pH而变化。环境pH低于其等电点时，带正电荷，在电场中向阴极移动；环境pH高于其等电点时，带负电荷，在电场中向阳极移动；当环境的pH等于其等电点时，则不带电荷，在电场中不移动。据此，在电泳系统中创造一个由阳极至阴极，pH由低到高(即环境由酸变碱)的连续而稳定pH梯度环境，那么处在这种系统中具有不同等电点的各种蛋白质，将据所处环境的pH与其自身等电点的差别，分别带上正电荷或负电荷，并向与它们各自的等电点相当的pH环境位置处移动，当到达该位置时即停止移动，从而各自焦聚(聚焦)，分别形成一条集中的蛋白质区带(图41—1)。这种根据蛋白质等电点的不同而将它们分离开的电泳方法称为等电聚焦电泳。电泳后测定各种蛋白质聚焦部位的pH，即可得知它们的等电点。图41-1蛋白质在电场中等电聚焦示意图在等电聚焦电泳中，造成环境由酸至碱逐步变化所用的物质是一类两性电解质。它具有依次递变但相差不大的等电点(p1)，在电场中可以形成逐渐递变而又连续的pH梯度。此类物质在等电点处具有足够的缓冲能力，以保证不致受蛋白质样品等两性物质对pH梯度的影响；在等电点处还具有足够高的电导，保证电流通过，而且整个体系的电导均匀，使样品迁移不受影响，达到聚焦；这类物质还具有不与分离物质反应或使之变性，自身化学性质不同于被分离物质，分子量也小，当电泳后经透析等可与被分离物质分开。1969年瑞典Vesterberg首先合成这种物质，随即由瑞典LKB公司以Ampholine为商品名供应于市。Ampholine是由多乙烯多胺(如三乙烯四胺、五乙烯六胺等)与丙烯酸(不饱合酸)进行加成反应而生成，是一系列含不同比例氨基和羧基的氨基羧酸的混合物。为无色水溶液，含量为40％，分子量300～1000范围。它的水溶性很好，1％水溶液中的紫外吸收(260nm)很低。商品Ampholine的pH有各种范围，最宽的为pH3—10，测定未知样品的等电点时，首先用Ampholine进行初步测定，根据测得的结果，再选择合适的pH范围较窄的Ampholine进行精确测定。为防止电泳过程中，因为对流现象使已经聚焦的蛋白质区带再昆合，需要一种能抗对流的介质作为电泳支持物。目前常用的有蔗糖、甘油或乙二醇形成的密度梯度；用琼脂糖、聚丙烯酰胺形成的凝胶及利用亲水惰性颗粒，如葡聚糖凝胶、淀粉、滤纸等为支持剂，以凝胶作支持物的称为凝胶聚焦电泳，这种方法适用于分析分离。其他支持剂适用于制备。等电聚焦电泳的优点在于(1)分辨率高，可将等电点相差0.01—0.02pH单位的蛋白质分开。(2)不像一般电泳易受扩散作用影响，使区带越走越宽；聚焦电泳则能抵消扩散作用，使区带越走越窄。(3)由于等电聚焦的作用，很稀的样品也可以聚焦而浓缩。(4)因为是根据等电点特性分离，所以重复性好，精确度高，可达0.01pH单位。其不足之处在于：(1)要求样品溶液无盐，因为盐会增大电流量，产生热量；盐分子移至两极时，将产生酸或碱，中和两性电解质。(2)要求样品成分在等电点时稳定，不适宜用于在等电点时不溶解或变性的蛋白质。等电聚焦电泳具有分离、制备及鉴定蛋白质、多肽的多种功能。本实验以柱状凝胶等电聚胶等电泳法测定牛血清清蛋白质的等电点，以掌握等电聚焦电泳的操作方法。.二试剂及器材(1)两性电解质Ampholine(瑞典Pharmacia公司新产品，称为Pharmalyte)Ph3-10，浓度40％。(2)丙烯酰胺溶液：称取丙烯酰胺(Acr)30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）1.0g，用蒸馏水溶解后定容至100ml，过滤，4℃贮存。(3)TEMED。(4)1.0％过硫酸铵溶液：临用时配制。(5)正极缓冲液：0.2％(V／V)硫酸或磷酸。(6)负极缓冲液：0.5％(V／V)乙二胺水溶液。(7)固定液：10％(W／V)三氯乙酸。(8)染色液：考马斯亮蓝R2502.0g以50％甲醇1000ml溶解。使用时取93m1，加入7.0ml冰醋酸，摇匀即可使用。(9)脱色液：按5份甲醇、5份水和1份冰醋酸混合即可。(10)牛血清清蛋白(生化试剂)，配成10mg／mI的水溶液。(11)电泳仪：100mA，600V。(12)圆盘电泳槽。（13）玻璃管：内径5cm，长80-100cm(14)微量进样器(100μl)，(15)7号(长10cm)针头和注射器。（16）聚焦指示剂：肌红蛋白(pI=6.7)、细胞色素C(pI=10.25)或甲基红染料(pI=3.75)（17）蛋白质等电点标准.三操作1.凝胶制备按表1的比例配制7.5％凝胶。吸取丙烯酰胺贮备溶液，过硫酸铵和水于50ml的小烧杯内混匀，在真空干燥器中抽气10min(本实验将此步省略，并不影响实验结果)。然后加入0.3mlAmpholine、0.1ml牛血清清蛋白待测样品和0.1mlTEMED溶液，混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部5mm处，在胶面上再覆盖3mm厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20～30min即可聚合。表1凝胶工作液配比30%凝胶贮液2.0ml1%过硫酸铵0.4ml水5.1mlPH3~10Ampholine0.3ml样品液0.1mlTEMED0.1ml凝胶一般选用3％一7.5％的浓度。7.5％浓度的凝胶具有较好的机械强度，又允许15万以下的球蛋白分子有足够的迁移率，应用较广。若使用较低浓度的凝胶时，可在胶中加入0.5％的琼脂糖，以增加凝胶的机械强度。2.点样根据等电聚焦的特点，对样品的体积和加样的位置不需严格要求。本实验采用将样品直接混入凝胶的加样方法，其优点是操作简单(具体操作见凝胶制备)。样品的体积可以很大，如每管可加样0.5ml以上。比较稀的样品可以不需浓缩，直接加样。若采用专用等电聚焦电泳槽水平板方法电泳(水平板凝胶做法与板状聚丙烯酰胺凝胶做法一样，做好的凝胶板水平放在特制电泳槽中进行电泳)，样品可以点在滤纸片上，把滤纸片放在凝胶表面离阴极端1／3处。等电聚焦的点样量范围比较大。柱状电泳点样量一般在5～100／μg，都能得到满意的结果。要提高点样量应该考虑到两性电解质载体的缓冲能力，随着点样量的增加，应该适当提高两性电解质的含量。为观察聚焦状况，可在样品中加入聚焦指示剂，如带红颜色的肌红蛋白(pI=6.7)、细胞色素（pI=10.25)或甲基红染料(pI=3.75)，以指示聚焦的进展情况。3.电泳吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。于电泳槽下槽加入0.2％的硫酸(或磷酸)作正极；上槽加入0.5％的乙醇胺(或乙二胺)作负极打开电源，将电压恒定为160V，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min后，停止电泳，全程约需3～4h。4.剥胶电泳结束后，取下凝胶管，用水洗去胶管两端的电极液，按照柱状电泳剥胶的方法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾”，若胶条的正、负端不易分清，可用广泛pH试纸测定，正极端呈酸性，负极端呈碱性。剥离后，量出并记录凝胶的长度。5.固定、染色和脱色取其中的凝胶条3根，放在固定液中固定3h(或过夜)，然后转移到脱色液中浸泡，换3次溶液；每次10min，浸泡过程中不断摇动，以除去Ampholine。量取并记录漂洗后的胶条长度。此时应注意不要把胶条折断或正、负端弄混。而后把胶条放到染色液中，在室温下染色45min，取出胶条，用水冲去表面附着的染料，放在脱色液中脱色，不断摇动，并更换3—5次脱色液，待本底颜色脱去，蛋白质区带清晰时，量取并记录凝胶长度。以及蛋白质区带中心至正极端的距离。6.pH梯度的测量常用的测定pH梯度的方法有三种：(1)切段法：将未经固定的胶条两根，按照从正极端(酸性端)到负极端(碱性端)的顺序切成0.5cm长的区段，按次放人有标号的、装有lml蒸馏水的试管中，浸泡过夜。然后用精密pH试纸测出每管浸泡液的pH并记录。有条件的，最好用精密pH计测定，可提高测定的精确度，本实验采用切段法测定pH梯度。(2)标准蛋白法：即选择一系列已知等电点的蛋白质进行聚焦电泳，经固定、染色、脱色后，测定各条区带到阳极端的距离，各种蛋白质所在位置的pH，就是它们各自的等电点。以此为标准，测知待测样品的等电点。(3)表面微电极法：即用表面微电极在胶表面上定点测定pH。7.结果测定(1)pH梯度曲线的制作：以胶条长度(nlm)为横坐标，各区段对应的pH的平均值为纵坐标，在坐标纸上作图，可得到一条近似直线的pH梯度曲线。由于测得的每一管的pH是5mm长一段凝胶各点pH的平均值，因此作图时可把此pH视为5mm小段中心区的pH，于是第1小段的pH所对应的凝胶条长度应为2.5mm；第2小段的pH所对应的凝胶条长度应为(5X2—2.5=7.5)mm；由此类推，第n小段的pH所对应的凝胶条长度应为(5n—2.5)mm。(2)待测蛋白质样品等电点的计算：①按下列公式计算蛋白质聚焦部位距凝胶柱正极端的实际长度(以Lp表示)：式中lp——染色后蛋白质区带中心至凝胶柱正极端的长度；21lllLpp×=l1——凝胶条固定前的长度；l2——凝胶条染色后的长度。②根据上式计算待测蛋白质的Lp，在标准曲线上查出所对应的pH，即为该蛋白质的等电点。附常见蛋白质等电点参考值蛋白质等电点鲑精蛋白12.1胸腺组蛋白10.8细胞色素C9.8-10.1珠蛋白7.5血红蛋白（人）7.07肌红蛋白6.99胰岛素5.35血清白蛋白4.7-4.9胃蛋白酶1.0左右