分子发光分析法

第五章分子发光分析法:基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。第一节荧光分析法一、概述:分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。二、荧光产生的基本原理（一）分子荧光的产生（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率2.荧光与分子结构的关系（1）产生荧光的条件①必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大，电子的离域性越强，越容易被激发产生荧光；大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。②分子的刚性平面结构有利于荧光的产生③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响给电子基团：-OH、-NH2、-NR2和-OR等可使共轭体系增大，导致荧光增强。吸电子基团：-COOH、-NO和-NO2等使荧光减弱。随着卤素取代基中卤原子序数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。3.环境因素对荧光强度的影响（1）溶剂极性对荧光强度的影响:一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大.奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。（2）温度荧光强度的影响:一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。对大多数的荧光物质而言，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光的影响比荧光更大。（3）pH对荧光强度的影响:共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。（三）荧光强度与溶液浓度的关系:可见，当A【250.05时，荧光强度与物质的荧光效率、激发光强度、物质的摩尔吸收系数和溶液的浓度成正比。对于一给定物质，当激发光波长和强度一定时，荧光强度只与溶液的浓度有关荧光猝灭：荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或26】f下降称为荧光猝灭。使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭碰撞猝灭——M+→M*M*+Q→M+Q+热自熄灭——荧光物质发射的荧光被它本身基态分子所吸收，即自吸收现象。（一）荧光分析仪器主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成。荧光分析仪与分光光度计的区别：第一：荧光分析仪采用垂直测量方式，在与激发光相垂直的方向测量荧光，以消除透射光的影响。第二：荧光分析仪有两个单色器，一个是激发单色器，用于获得单色性较好的激发激发态的分子数发荧光的分子数）荧光效率（fKcIf光；另一个是发射单色器，用于分出某一波长的荧光，消除其它杂散光的干扰。1.光源：激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽。荧光计中，常使用卤钨灯作光源。荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯。2..单色器：荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱。大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。第一单色器作用：ex，用此激发光激发液池内的荧光物质【33】ex第二单色器作用：滤掉一些杂散光和em。em下测定荧光强度，定量分析。3.样品池：盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边。4.检测器;把光信号转化成电信号,放大,直接转成荧光强度。荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管。荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可大大提高荧光强度。5.读出装置:记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱。四、荧光分析法的应用（一）无机化合物的分析:能够同金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物。它们通常含有两个或两个以上的官能团，能与金属离子形成五元或六元环的鳌合物。由于鳌合物的形成，分子的刚性平面结构增大，使原来不发光或发光较弱的化合物转变为强荧光化合物。（二）有机化合物的分析1.脂肪族的有机化合物的分子结构比较简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析。2.芳香族有机化合物因其具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光，可以直接用荧光法测定。为了提高灵敏度，有时候也将芳香族化合物与适当的试剂反应之后再进行测定。第二节磷光分析法一、基本原理（一）磷光的产生和磷光强度:磷光是由处于激发三重态的分子跃迁返回基态时所产生的辐射。与荧光比较，磷光的特点：（1）磷光辐射的波长比荧光长；（2）磷光具有较长的寿命（10-4~10s）；（3）磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子非常敏感。当磷光物质浓度很小时，磷光强度Ip与磷光物质浓度c之间的关系为：（二）温度对磷光强度的影响：在室温条件下，磷光很难产生。随着温度的降低，分子热运动减慢，磷光逐渐增强。当溶液在液氮中冷冻至玻璃状时，某些物质可以产生很强的磷光。低温磷光分析就是基于这一原理而建立起来的。（三）重原子效应：重原子的高核电荷使磷光分子的容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1→T1的体系间窜跃概率增大，有利于增大磷光效率。目前应用较多的除重原子溶剂外，还可以采用碘化物，Ag+盐、Pb2+盐和Ti+盐也有应用。（四）室温磷光1.固体基质：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。2.胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性。二、磷光分析仪器荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。(一）样品池盛试液的石英液槽需放置在盛液氮的石英杜瓦瓶内。（二）磷光镜利用磷光镜不仅可分别测出荧光和磷光强度，而且可以测出不同寿命的磷光。KcIp第三节化学发光一、概述:化学发光分析是利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分析方法。化学发光具有下列突出特点：（1）灵敏度高。例如，用荧光素酶和腺苷三磷酸（ATP）的化学发光反应，可测定低至210-17mol/LATP；利用鲁米诺化学发光体系测定Cr3+、Co2+等离子的检出限也低至10-12g/L。（2）测定的线性范围宽。一般有5-6个数量级。（3）分析速度快。流动注射化学发光分析每小时可测定100个以上的试样。（4）仪器设备简单。二、基本原理（一）化学发光反应的条件A+B→C*+DC*→C+hv产生化学发光必须具备的条件：（1）能快速地释放出E=hv计算，在可见光区观察到的化学发光，需170～300kJ/mol激发能。一些氧化还原反应，特别是具有过氧化物中间产物的氧化还原反应可满足这种要求。（2）反应途径有利于激发态产物的形成。（3）激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态，或能够将其能量转移给可以产生辐射跃迁的其他分子。（二）化学发光效率和发光强度化学发光效率【55CL定义为：r和激发态分子的发光效率【56f之乘积。（三）化学发光反应的类型1.液相化学发光2.气相化学发光三、化学发光分析的仪器（一）分立取样式仪器分立式化学发光分析仪是一种静态下测量液相化学发光信号的装置。特点：仪器简单、灵敏度高，可用于反应动力学的研究。缺点：重复性差，测量的精密度不高，难于实现自动化，分析效率也比较低。二）流动注射式仪器frCL参加反应的分子数发射的光子数参加反应的分子数激发态分子数r激发态的分子数发射的光子数f