分子标记技术在昆虫学研究中的应用

分子标记技术在昆虫学研究中的应用摘要：综述了几种在昆虫学研究中常用的分子标记,包括随机扩增多态性(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、微卫星(SSR)、小卫星(Minisatellites)、DNA测序及单核苷酸多态性(SNP)。对各类分子标记的原理进行了简要的介绍,并对其在应用上的优缺点进行了分析。分别列举了近年来各类分子标记在昆虫学研究中的实例,对其在昆虫学中的应用作了进一步的阐明。关键字：分子标记;RFLP;SSR;RAPD;AFLP;昆虫学分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。DNA分子标记有以下优点:(1)具有较强的多态性;(2)直接以DNA为表现形式。不受环境、季节限制,不受个体发育阶段的影响,不存在基因表达与否的问题,没有组织及器官特异性。(3)许多分子标记表现为共显性(4)数量的丰富性(5)表现为“中性”(6)经济方便和易于观察记录。1应用于昆虫学中的分子标记分子标记(DNA标记)指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段,它直接反映基因组DNA间的差异。按照分子标记的性质来分,可以分为蛋白质标记与DNA标记两类,鉴于蛋白质标记近年来已很少被采用,本文就只对较常用的DNA标记进行讨论。迄今为止已有许多的DNA标记应用于昆虫的研究,较常用的有RAPD(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA),RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism),AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism),Microsatellites(SimpleSequenceRepeats,SSR),Minisatellites,DNAsequencing及Singlenucle-otidepolymorphism(SNP)等。1限制性片段长度多态性RFLP限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)作为分子标记是由D.Botstein等人于1980年提出来的,是第一代DNA标记。RFLP是指用限制性内切酶切割不同个体的DNA时,会产生长度不同的DNA片段,因为酶切位点(通常为4～6个碱基对)的变化使得酶切后的DNA片段长度发生了改变。1.1RFLP的特点RFLP按简单的孟德尔式共显性遗传,与传统的遗传标记相比,它具有较好的稳定性不受年龄、性别、基因产物的影响，并且在基因组中分布广泛。数量较大。但RFLP也有其局限性。由于RFLP对于多态性的检测仅限于酶切位点的“能切”与“不能切”两种状态，产生的片段较少，因此只能提供较少的多态性信息。传统的RFLP的操作过程中需要使用DNA探针,这无疑增加了其使用成本及对实验条件的要求。目前，这一技术已经得到改良，通过预先对靶基因进行PCR，再利用内切酶进行反应，直接通过观察电泳后的凝胶即可对其结果进行析，而无需标记或放射性探针。1.2RFLP在昆虫学中的应用RFLP标记是一种灵敏而有效的分子标记,它可利用昆虫遗传多态性推断昆虫因迁飞导致不同地理种群基因流动的事件。徐广等人利用DDC探针进行RFLP分析,对不同棉铃虫的纯合或杂合品系进行鉴别,进而进行了遗传学研究【5】。他们进行的RFLP标记比蛋白质水平的等位酶标记揭示了更多的遗传变异,这是由于不同序列的DNA能够编码相同的蛋白质,即使在蛋白质水平不表现差异,在DNA水平也可能有较大不同,也反映了RFLP是一种灵敏的分子标记方法。RFLP分析其简便快速实用的特点而被普遍应用于群体遗传变异的研究中。从分子水平研究昆虫的进化生物学有助于我们确定昆虫种类的分类地位理清种间及种内的系统发生关系。邵红光等以11种限制性内切酶对新疆荒漠中的9种束颈蝗和与其近缘的细距蝗Leptopternisgracilis,旋跳蝗Helioscirtusmoserimoseri及远缘的意大利蝗Calliptamusitalicusitalicus,红翅瘤蝗Derico-rysroseipennis的线粒体DNA进行了长度片段多态性的研究[1]。RFLP方法操作烦琐费,且需要接触放射性同位素,这限制了该方法在昆虫种群遗传学方法的应用。随着PCR技术的发展,可以此研究的基础上,以限制性内切酶直接消化PCR产物,可采用PCR-RFLP的方法进行大样本分析。2随机圹增多态性DNA（RAPD）1985年,美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(Polymer-aseChainReaction,简称PCR)。在这一技术的基础之上，Williams等和Welsh等在1990年分别提出了另一种DNA多态性检测技术，命名为随机扩增多态性DNA(简称RAPD)。2.1RAPD的特点RAPD这一分子标记自出现以来,由于其低廉的使用成本,简单而程序化的操作，以及广泛的检测范围，受到广大学者的青睐。然而与其它的分子标记比较起来，RAPD有其致命的弱点。RAPD一般表现为显性遗传，不能区分显性纯合与杂合基因型，因而提供的信息不完整。同时由于RAPD所使用的引物较短，专一性差，极容易从模板链上脱落，因些具有较差的重复性。2.2RAPD在昆虫中的应用在昆虫分类和系统演化研究中，RAPD技术因其简便、灵敏、对材料要求不高等特性，一出现就很快被昆虫学界所认可，并且广泛应用于种属的分类鉴定、种下分类、遗传连锁图的构建等多方面的研究[2]。Hechel(1990)首次用R.APD技术对美洲葵夜蛾进行了分析，研究了DNA片段的类型，建立了种间的DNA图谱。而国内，昆虫学工作者应用RAPD技术于昆虫学研究起步较晚，赵郁光等(1994)用RAPD技术鉴定了4个蚊细胞系。夏庆友等(1998)利用RAPD标记，在DNA分子水平上对不同系统、化性和眠性的59个家蚕和野蚕之间的遗传差异进行了研究。陈永久等(1998)研究了云南微小按蚊随机扩增多态DNA及遗传分化关系。杨效文等(1999)利用RAPD技术分析了我国烟蚜种群的遗传多态性及其分化关系。韩雅莉(1997)首次将RAPD技术用于蝗虫的基因组DNA多态性研究，在100个引物中，筛选出5个特异性引物，对蝗总科4科10属19种的基因组进行了扩增，结果与现有的形态分类关系基本一致[4]。3简单重复序列DNA（SSR）微卫星DNA标记是一类由几个核苷酸(通常不超过6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。其长度可达到500bp,分布于基因组的各个部位,包括编码区与非编码区。它与小卫星的区别是,其核心序列更小,且在基因组中呈均匀分布,呈共显性的孟德尔式遗传。微卫星的多态性来自于核心序列重复数的不同,重复数越大,其变异性也越大，等位基因数也就越多。3.1SSR的特点与其它分子标记相比，SSR具有许多优点。它具有等位基因变异多、单基因座、信息含量高、多态性高；稳定性好、重复性好；种族特异性强、进化所受选择压小；以孟德尔方式分离、呈共显性遗传等等。3.2SSR在昆虫学中的应用在进行种群遗传结构与遗传多样性分析时，微卫星标记能提供更为丰富的种群遗传学信息，微卫星分子标记适合于研究种群遗传多样性性和遗传变异的研究。近年来SSR分子标记技术己开始应用于昆虫学研究。韩海滨等人首次应用SSR标记技术对内蒙古巧个不同地点亚洲小车蝗种群的遗传多样性及种群间的分化进行分析，以期揭示不同地区亚洲小车蝗种群间的遗传分化和基因交流程度，进而从分子水平探索不同地区亚洲小车蝗种群间的内在联系，为制定亚洲小车蝗的综合治理策略提供必要的基础。邓菲菲研究中利用RAPD标记和SSR标记技术分析了新疆棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hubner)不同地理种群的遗传多态性。4扩增片段长度多态性（AFLP）AFLP是由Zabeau等(1995)发明的一种RFLP与PCR技术相结合的遗传标记技术,它是通过对基因组DNA的限制性片段进行选择性地扩增以检测其多态性,即先对基因组进行酶切,然后再有选择地对目的片段进行扩增。AFLP的实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性,只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。4.1AFLP的特点AFLP呈典型的孟德尔式遗传,为共显性标记且适于进行自动化分析。这一标记具有提供的信息量大、能够检测出较多的多态性等特点。它兼有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。其不足之处是需要使用同位素和非同位素来标记引物,因此比较费财耗时。4.2AFLP在昆虫学中的应用程茂高等人用东亚飞蝗为材料对蝗虫基因组DNA双酶切的反应体系及条件进行研究，他们在此试验中运用AFLP分子标记，为蝗虫AFLP遗传多样性研究提供必要条件。也为AFLP技术在其他昆虫及动物研究中的应用提供了依据[12]。马晋在他的研究中采用AFLP分子标记技术探讨了我国由北到南不同地理分布的中华稻蝗种群间遗传结构和遗传多样性水平[17]。应用分子遗传标记技术(AFLP)对黑化粘虫和我国东部不同地区的粘虫种群进行DNA标记，明确黑化粘虫在基因水平上的变异本质、迁飞在不同地区种群间基因交流中的作用以及黑化粘虫与正常粘虫间遗传相似性，从而揭示粘虫种群的遗传变异和遗传多样性，并对寻找黑化粘虫DNA分子标记在粘虫迁飞型分化研究中的意义进行探讨[8]。5Singlenucleotidepolymorphism(SNP)单核苷核酸多态性通常是指不同个体间DNA水平上单个碱基的差异。它被称为继限制性片段多态性(RFLP)及微卫星多态性之后的第三代遗传标记。SNP包括碱基替换、颠倒、插入及缺失等形式,其中有些突变会造成其编码氨基酸的改变,称为同义SNP,而大部分通常不会造成氨基酸的变化,被称为非同义SNP。文献综述:[1]邵红光，严健，庚镇城.新疆荒漠束]颈蝗属及其近必远缘种的线粒体DNARFLP与系统进化[J].昆虫学报,1999,42(2):133～139.[2]刘波，稻蝗及其近缘属部分种RAPD多态性及中华稻蝗种群遗传多态性研究[D].2000.[3]朱道弘,安藤喜一,城田安幸.利用RAPD对稻蝗属昆虫亲缘关系的研究[J].昆虫学报,2001,44(3):31～6320.[4]韩雅莉.六种蝗虫基因组DNA多态性的RAPD标记研究[J].汕头大学学报,2001,16(1):40～43.[5]徐广，王桂荣,吴孔明.棉铃虫不同地理种群间基因流动的RFLP分析[J].棉花学报,2002,14(6):352～355.[6]李茂海，丛斌，李建平.分子生物学在昆虫系统学研究中的应用[J].吉林农业科学2003,28(5):30-33.[7]张建珍，马恩波,郭亚平.稻蝗属部分种类及其分子系统学关系[J].遗传学报,2003,30(6)533-539.[8]江幸福.粘虫迁飞行为的生理、遗传特征以及遗传多样性的AFLP分析[D].2004.[9]吉亚杰,张德兴.鳞翅目昆虫基因组中微卫星DNA的特征以及对其分离的影响[J]动物学报}2004,50(4):608-614.[10]闰路娜,张德兴.种群微卫星DNA分析中样本量对各种遗传多样性度量指标的影响[J]动物学报,2004,50(2):279-290.[11]张建珍,马恩波,郭亚平.网翅蝗科四种蝗虫的RAPD多态性研究[J].动物分类学报,2004,29(2):212-217.[12]程茂高，乔卿梅,原国辉.适于蝗虫AFLP标记的酶切反应系统研究[J].河南农业科学,2005,2006（2):64-66.[13]张民照,康乐.飞蝗地理种群在中国的遗传分化[J].生命科学,2005,35(3):220-230.[14]党丽.山西部分农业蝗虫种群遗传结构的研究[D].2006.[15]张建珍.中国稻蝗属遗传分化研究[D].2006.[16]赵俊杰,陶令霞.序列在蝗虫分子系统学研究中的应用[J].四川动物,2007,26(1):227-229.[17]马晋.中华稻蝗A