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生物工程下游技术学院：资源环境学院专业：生物技术1102班姓名：李红秀学号：311103050201指导老师：李刚分子标记技术在动植物育种研究中的应用摘要分子标记是继形态标记、细胞标记和生物化学标记之后发展起来的一种的较为理想的遗传标记形式,近年来发展非常迅速。本文主要介绍几种应用在植物育种中的分子标记技术。分别阐述了它们的原理、方法步骤与优缺点、应用范围等。关键词分子标记植物育种应用分子标记（MolecularMarkers），是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，其研究始于20世纪80年代，它是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记如形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，具有很多的优点，大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性标记；检测手段简单、迅速等而被的广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。本文主要论述几种植物育种中的分子标记技术。1分子标记技术种类1980年Bostern将生物个体之间DNA序列的差异作为标记用于遗传作图，从此开创了在DNA水平上研究遗传变异的新阶段。现阶段，随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，主要包括3种类型：一是建立在Southern杂交基础上的分子标记技术，如限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)、染色体原位杂交(CISH)；二是以PCR为基础的分子标记技术，它包括随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单链构象多态性(SSCP)、靶位区域扩增多态性(TRAP)、序列特征化扩增区域(SCAR)、相关序列扩增多态性(SRAP)等。第三类是基于DNA芯片技术的分子标记，如单核苷酸多态性（SNP）表达序列标签（EST）等[1]。目前,用于植物育种的分子标记主要有限制性片断长度多态性（RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、微卫星DNA(SSR)又称简单重复序列，扩增片断长度多态性(AFLP)等。2限制性片段长度多态性(RFLP)RFLP是应用最早的分子标记技术,1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性（RFLP）技术，1980年Botesin提出RELP可以作为遗传标记，开创了直接应用DNA多态性的新阶段。RFLP原理为当用特定限制性内切酶处理不同生物体的DNA时,所产生的大分子片段长度可能不相同,这种限制性片段长度的差异就是限制性片段长度多态性,当这些长度不同的片段通过凝胶电泳时,就形成不同的带,再通过与克隆的DNA探针进行Southern杂交和放射自显影后,即获得反映个体特性的RFLP图谱,依据限制性片段或位点的差异,计算DNA间的遗传距离,据此来判定个体间、群体间或种间的差异。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。RFLP标记具有共显性的特点,标记位点不受数量限制，可以区别纯合基因型和杂合基因型,能够提供单个位点上的较完整的资料。但是RFLP标记对DNA的需要量较大，克隆能表现基因组DNA多态性的探针较为困难，而且实验操作较繁琐、检测周期长、费用高，主要适用于研究进化关系较近种之间的系统发生关系,而用于相距较远种时需特别小心,因为较远种间的酶切片段同源性差,不能清晰地推演种间进化关系。RFLP遗传图谱是植物遗传育种研究中的一个热点.结合RFLP连锁图,任何能用RFLP探针检测出的基因及其DNA片段都可以通过回交快速、有效地进行转移.尤其是分离群体中进行目标性状的检测和筛选时,不再需要等到目标性状表达,大大缩短了传统回交育种的周期,减少了后期的筛选.李平等也利用RFLP标记构建了一张水稻分子连锁图谱。黄烈健采用RFLP标记构建了包含124个标记的玉米RFLP连锁图,覆盖玉米基因组1999.8CM,标记间平均距离为16.5CM[3]。原始种、野生种和老品种中存在丰富的基因资源.如抗病基因、抗逆基因,及一些特殊用途的基因等.传统方法在转移这些基因时受到很大的限制,主要是因为无法保证种质资源中的目标基因实现转移.利用RFLP技术能够准确地标记定位种质中的目标基因,结合杂交、回交、组培等标记就可以快速有效地将所需目标基因的DNA片段引入栽培品种中,实现品种改良.因此在遗传育种研究中运用RFLP进行基因定位十分广泛[4]。3随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD，即随机扩增多态性DNA技术，是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。RAPD是建立在PCR基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列为引物，在热稳定的DNA聚合酶或Taq酶作用下，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性[5]。基因型不同的品种或不同亲缘关系的物种,基因组内核苷酸序列存在差异。当使用同一随机引物对不同基因组体外扩增时,基因组上与引物互补的DNA片段的数目、位点是不同的,因而其扩增产物的大小、数目也不同,亦即扩增产物表现出多态性。当使用一系列不同的随机引物扩增时,这种多态性更加丰富。这种扩增产物的多态性反映了被测材料的遗传多样性。进一步通过相关分析、聚类分析等数量遗传分析手段,还可以对不同亲缘物种间的分类、遗传距离、系统发育、亲缘关系等进行研究。通过RAPD分析可以筛选出与目标基因连锁的DNA片段,作为辅助育种的分子标记。很多植物的目标基因已经找到与其连锁的RAPD分子标记,这些标记在植物育种中发挥了重要作用。近等基因系是由提供目标基因的亲本同轮回亲本杂交,并连续回交,经每代对目标基因选择而获得。近等基因系也可以由自然突变或诱发突变产生。利用RAPD对这两种基因组DNA进行多态性检测,找出两种基因组扩增产物的差异,并以这些差异产物为探针,经RFLP分析即可定位此基因。通过检测远缘杂种或体细胞杂种中特异性RAPD标记的有无,可以鉴定杂种的真实性。也可以通过建立品种(组合)的RAPD指纹档案,用来鉴定品种纯度,为种子质量提供可靠资料,或用来保护品种专利[6]。4简单重复序列(SSR)简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1-6bp，其中最常见是双核苷酸重复，即(CA)n和(TG)n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10-60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。SSR具有很多优点，SSR数量极为丰富，而且分布于整个基因组,多态性高，等位位点多，因此信息含量极为丰富.它一般检测到的是一个单一的多等位基因位点且呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子，另外所需DNA量少。然而，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。近年来，SSR作为分子标记所具有的优点使其在植物遗传育种中得到广泛应用。SSR作为以PCR为基础的第二代分子遗传标记，是构建高密度分子遗传图谱的有效工具。近年来，国内外许多学者利用标记构建了许多植物的图谱。通过研究DNA的差异来分析群体的遗传结构及遗传多样性更为直接，对正确评价植物种质资源的遗传多样性、制订育种策略十分重要。在水稻、玉米、小麦、大麦、大豆等作物中，SSR的多态性显著高于RFLP。郭小丽等利用108对SSR引物对36个优质小麦品种和来自不同生态区的12个普通品种进行了遗传差异分析和比较研究，共扩增出705个等位位点，平均每个位点有6.53个等位变异，其中B组位点的变异最多，聚类结果和品种的系谱来源及地域相吻合[7]。杂种优势是指两个遗传组成不同的亲本杂交产生的F1在扣除上位性效应后产生的比亲本具有更强的生活力、生长势、适应性、抗逆性和丰产性等现象。国内外学者对杂种优势的产生曾提出过显性假说、超显性假说、生活力学说、活性基因效应假说等观点。现代杂种优势理论认为，杂种优势的强弱在一定程度上取决于亲本间遗传差异的大小。番兴明等利用SSR标记技术对18个优质蛋白玉米自交系和4个代表国内主要杂种优势群的普通玉米标准测验种进行了杂种优势群划分，划分结果与田间产量配合力划分结果及系谱分析基本一致[8]。参考文献[1][2]李平,朱立煌,周开达,等.利用分子标记和水稻籼粳交双单倍体群体进行遗传作图研究[Ｊ].植物学报,1996,38(11):881-886.[3]黄烈健,向道权,杨俊品,等.玉米PFLP连锁图谱构建及大斑病QTL定位[Ｊ].遗传学报,2002,29(12):1100-1104.[4]张汉尧,刘小珍,等.RFLP在植物遗传育种研究中的应用[J].西南林学院学报，2006,26(1):1003-7192.[5]闰华超,李桂兰,等.分子标记技术的发展及应用[J].生物学通报，2006,41(2).[6]谭振波,郭瑞星,等.植物RAPD标记的发展及其在遗传育种中的应用[J].玉米科学，2005，13(2):8-11.[7]郭小丽，刘冬成，罗静，等.我国部分优质小麦品种遗传差异的SSR标记分析[J];麦类作物学报，2004，24(1):1-5.[8]番兴明，张世煌，谭静，等。根据SSR标记划分优质蛋白玉米自交系的杂种优势群[J].作物学报，2003，29(1)：105-110..