分子生物学DNA的复制损伤与修复

Replicationanddamagerepair第二章DNA的复制、损伤和修复第一节DNA的复制(Replication,DNAbiosynthesis)指DNA双链在细胞分裂以前进行的复制过程。哺乳动物的细胞周期（一）半保留复制DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservativereplication)。意义：半保留复制说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制，DNA链仍可保持完整，这在生物的遗传上是十分重要的。一、DNA复制特征DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作CsCl密度梯度离心.半保留复制证据（以原核生物大肠杆菌为例）原料：dNTP，Mg++双链DNA模板引物（primer），常是RNA，有游离的3’OH。引物酶（primase，DnaG），用于合成复制所必需的RNA引物解螺旋酶(helicase),DnaB,由DnaA和DnaC协助在复制的起始点（OriC）上解开双螺旋。与复制有关的酶和因子复制的起始点与方向亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移动复制叉亲代DNA分子3’5’3’5’复制起始点（ori）：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位称复制起始点原核：一个起始点，约245bp,特殊的重复序列真核：多个起始点oriE.coli复制起始点oriC跨度为245bp，包括两个关键序列：13bp的序列和9bp序列,它是决定和控制E.coli染色体复制的唯一片段。13bp序列区，每一个顺序都由GATC开始，富含A和T，有助于螺旋解开，控制复制何时开始。9bp重复序列，重复出现4次，能与起始蛋白dnaA特异结合，当dnaA蛋白（约20种）结合于ori的4个部位上时复制开始。dnaA蛋白（一种专一的蛋白）和ori结合后，双螺旋解开形成复制叉。故dnaA蛋白与启动解链有关,dnaA蛋白是起始的关键成分。大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACADnaA蛋白结合位点四个9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型复制方向DNA合成的方向单向、双向？1个起始点双向复制oriori复制子oriori真核生物两个相邻复制起始点之间的DNA片段以起始点为中心，向两个方向进行复制多个起始点二、DNA复制的酶学1.模板：解开成单链的DNA母链3.DNA聚合酶，DNA-pol2.底物dNTP：dATP，dGTP，dCTP，dTTP4.引物（primer）：RNA引物5.其他酶和蛋白质因子一、复制的化学反应生成磷酸二酯键N1OH3`5`+dN2TPN1N2-OH3`5`+PPiDNApol3’——TAGAAGACCTATTGGCC——5’5’——ATCTTCTGGATAACCGG——3’二、解链相关酶类1.解旋酶(helicase)2.拓扑异构酶（topoisomeraseI、II）3.单链DNA结合蛋白(SSB)DNA解旋酶(helicase)（解链酶）功能：DNA的双螺旋解链（解DNA双链），解开一对碱基，需2分子ATP，作用点：DNA上局部单链处，向双链方向解链。种类：E.coli有四种解螺旋酶，I、II、III和rep蛋白。I、II、III中任一种沿模板5'-3'方向移动，rep蛋白沿模板3'-5'方向移动。5′3′5′3′rep2.拓扑异构酶（Topo）DNA正超螺旋与负超螺旋负超螺旋正超螺旋DNA双螺旋拓扑异构酶首先在大肠杆菌中被发现，它可使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量。另外，DNA复制时负超螺旋的消除，亦由拓扑异构酶Ⅰ来完成，但它对正超螺旋无作用。Ⅰ型拓扑异构酶由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。它能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋以消除复制叉前进带来的扭曲张力时，需要由ATP提供能量。两种拓扑异构酶在DNA复制、转录和重组中均发挥重要作用。Ⅱ型拓扑异构酶拓扑异构酶I抑制剂：喜树碱类拓扑异构酶II抑制剂：依托泊苷，多柔比星，阿霉素类等3.单链DNA结合蛋白（SSB）作用：防止单链DNA重新形成双链，防止单链DNA被核酸酶水解SSB三、DNA聚合酶（DNA-pol）即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）真核生物有多种：DNA-pol、、、、…原核生物有3种：DNA-polⅠ、Ⅱ、ⅢDNA聚合酶功能5´3´聚合作用5´3´外切酶3´5´外切酶活性大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用转化率主要功能活性（nt/min）DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅲ（复合物）109，000400+++1校读,修复1000120，00040++-0.05400，00010-20+++50复制100000特性不清填补缺口50四、引物酶(Primase)和引发体5´5´催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶DNA合成需在RNA引物的基础上进行5´3´5´3´DnaA引发体（primosome）：包括解螺旋酶、DnaC、引物酶及DNA复制的起始区域5´3´3´5´引物酶DnaC引发体解螺旋酶小结主要成员主要作用DnaA识别复制起始位点解螺旋酶解开DNA双链SSB维持已解开单链DNA的稳定引物酶合成RNA引物TOPO使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰DNA-polⅢDNA复制DNA-polⅠ水解引物、填补空隙、修复作用DNA连接酶催化双链DNA中单链缺口的连接第三节DNA生物合成过程1.复制的起始2.链的延长3.复制的终止一复制的起始(一)DNA解成单链由特定蛋白质识别复制起始位点（ori），在解螺旋酶、TOPO酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下，DNA解链，解旋，形成复制叉倒Y(二)引发体的生成解旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体5´3´3´5´引物酶DnaC引发体解旋酶（三）RNA引物的合成5´5´5´3´5´3´参与复制起始的蛋白因子名称功能DnaA蛋白辨认起始点解螺旋酶（DnaB，Rep）解开DNA双链DnaC协助解螺旋酶引物酶（DnaG）催化RNA引物生成SSB稳定解开的单链拓扑异构酶理顺DNA链OriCE.coli复制起始点领头链的合成复制过程简图555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA连接酶•随从链上不连续性片段的连接二、真核生物DNA生物合成（一）DNA的复制只发生在S期（二）多复制子（三）真核细胞含有5种DNA聚合酶（四）端粒复制染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。53355335+53333551.端粒telemer：指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。2.结构特点：（1）由末端单链DNA序列和蛋白质构成。（2）末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。3.功能：（1）维持染色体的稳定性（2）维持DNA复制的完整性4.端粒酶：由RNA和蛋白质组成（1）RNA发挥模板作用（2）蛋白质发挥逆转录酶活性端粒酶的催化延长作用爬行模型DNA聚合酶复制子链进一步加工引物合成后，由DNApolⅢ（在真核细胞为DNA聚合酶和)催化，按碱基配对原则，将dNTP逐一添加到引物3’末端，形成磷酸二酯键，使新合成的链不断延长二复制的延长3’——AAGACCTATT——5’5’——TTCTGGATAA——3’DNAPolI,IIandIII5’-DNA-OH5’-DNA-O-P-N-OHPP++dNTPs前导链后随链3’5’3’5’延长5’5’5’3’3’5’3’3’5’SSBDNAPolymerase冈崎片断RNA引物引物酶5’3’5’TOPOⅡ解旋酶（三）终止阶段原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriterE.coli8232oriterSV40500半不连续复制(semi-discontinuousreplication)领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。3535解链方向领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)基因组能独立进行复制的功能单位称为复制子(replicon)，每个复制子都含有控制复制起始的起点(origin)，可能还有终止复制的终点(terminus)。每个起始点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时，复制叉相遇并汇合连接。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子。（2）复制子DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制.但在低等生物中,也可进行单向复制（如滚环复制）①.原核细胞：染色体和质粒固定起点双向复制，②.真核生物：染色体DNA，复制时多个起始点。（3）复制方向三、需要引物DNA聚合酶不能直接聚合游离的dNTP，必须由一段核酸片段提供3’OH末端作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。四、双向复制DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。五、半不连续复制（semidiscontinuousreplication）由于DNA聚合酶只能以5’→3’方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为3’→5’。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。定义：在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以3’→5’方向的母链作为模板指导新的链以5’→3’方向连续合成;另一股以5’→3’为方向的母链则指导新合成的链以5’→3’方向合成1000—2000个核苷酸长度的许多不连续的片段（岗崎片段）。这种复制方式称之为半不连续复制。PPPOH+OHPPPOHPPPPPPOHOH+PDNA合成方向不可能是3′→5′的解释5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’前导链随从链岗崎片段半不连续复制以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5'→3'，这一条链被称为领头链(leadingstrand)。而以5'→3'方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是5'→3'，这条链被称为随从链(laggingstrand)。前导链：在引物的3’端按5’→3’方向连续不断地合成的DNA链。随从链：在引物的3’端按5’→3’方向不连续合成的DNA链。冈崎片段：随从链上不连续合成的DNA短片段（不包括引物）由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。五、DNA聚合酶（DNApolymerase）聚合酶III——主要的复制酶，兼有校读、纠错的功能有从5’——3’延伸多核苷酸链的聚合酶活性，有模板依赖性，其延伸的方式是依据碱基互补配对的原则，将原料dNTP与末端核苷酸游离的3’OH以3’,5’磷酸二酯键连接，同时释出一个PPi。DNA聚合酶延伸多核苷酸链的方向总是5’3’有从3’——5’外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸聚合酶I用于切除引物RNA,并填补留下的空隙有从5’——3’延伸多核苷酸链的聚合