分子生物学分析

2.6分子生物学分析目前较常采用的微生物学分析方法有两种，一种是使用传统的微生物培养技术（culture）将微生物富集、分离，然后通过一般的生物化学性状或表现型来分析的间接途径。然而使用传统的微生物培养技术存在许多困难，尤其是环境中大多数微生物生长缓慢，例如本论文研究中针对的anammox菌的培养富集时间均在2年以上，同时对培养条件要求极为苛刻，客观上阻碍了采用这种方法对其的研究。第二种途径依靠聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术及应用进化和功能基因探针直接从环境样品中检测和分析目标微生物，不需富集培养。分子生物技术有简洁、快速、精确等特点，广泛应用于微生物生态学研究中。尤其是目标微生物主要功能基因的DNA序列数据库和PCR技术结合在一起，使许多分子生态学手段可以直接应用于环境样品的研究中，，推动了环境中微生物生态学研究。本论文研究中采用了第二种途径中的定量PCR技术手段。下面将根据实验中的具体操作进行叙述。2.6.1DAN提取本文研究中主要采用的是试剂盒提取方法。DAN提取盒使用美国MP公司的土壤DNA提取试剂盒（FastDNASPINKitforSoil，MPBiomedicals,SantaAna,USA）。提取方法依据说明书进行微小变动，即向污泥中先加入SodiumPhosphateBuffer（磷酸钠缓冲液），再将其移至LysingMatrixE管中，具体操作方法如下：（1）向1.5ml取回污泥离心（10000rpm×10分钟）的湿污泥加入978μlSodiumPhosphateBuffer（磷酸钠缓冲液），然后将其移到LysingMatrixE管中（尽可能将其全部加入），然后加入122μlMTBuffer（MT缓冲液）。注：因为FastPrep®仪器的剧烈运动，在LysingMatrixE管内会形成巨大的压力，样品和基质的总体积不能超过管体积的7/8；留一些空间也会提高混匀效果。（2）在FastPrep®中处理上述离心管，速度6.0，40秒。（3）LysingMatrixE管离心14000g×15分钟。（4）将上清液转移到一个新的2ml离心管（自备）中，加入250μlPPS，并用手上下颠倒10次进行混合。（5）离心14000g×10分钟，至形成白色状沉淀物，将上清液转移到一个新的10ml离心管（自备），并加入1mlBindingMatrixSuspension（在用之前重悬BindingMatrixSuspension，一定要摇匀到瓶底看不见沉淀为止，加5个摇一次以防止放置时间而沉淀）。（6）用手上下颠倒2分钟，使DNA附着到基质上，把离心管放到架子上静置3分钟。（7）小心去除500μl上清，避免扰动沉淀的BindingMatrix，重悬剩余的上清；转移大约600μl的混合液到一个SPINTMFilter中，离心14000g×2分钟；将SPINTMFilter下面catchtube中的液体倒掉；重复上述过程（重悬→移液→Filter→离心→弃catchtube中的液体）直到剩余混合液全部转移离心完（8）加入500μlSEWS-M到SPINTMFilter中，利用移液枪的挤压重悬。（9）离心14000g×2分钟，将下面catchtube中的液体轻轻地倒掉，重复以上操作一遍。（10）减掉SPINTMFilter盖子，不加任何东西离心14000g×2分钟，去除基质中的SEWS-M。（11）将SPINTMFilter放到一个新的CatchTube中，在室温下风干SPINTMFilter15分钟。（12）加入80uLDES，用手轻弹侧壁至液体与粉末充分混合，使滤膜上的沉淀物重悬，从而使DNA有效洗提；55℃加热5min，离心14000g×2分钟，使DNA转移到CatchTube中。可重复此步，已达到最大量的提取DNA的目的。（13）使用DNA测定仪（NANODROP1000）测定样品中DNA的浓度（ng/uL）和纯度（A260/A280和A260/A230）。2.6.2PCR扩增（1）PCR简介PCR是一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术，又称无细胞的分子克隆法。它利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行DNA体外合成反应。由于PCR循环可进行一定次数（通常为25-35个循环），所以在短时间内即可扩增获得大量目的基因。PCR作为一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，具有特异性强、灵敏度高和简便快速的特点，在环境微生物学领域得到了广泛的应用。PCR反应由变性、退火、延伸三个基本反应步骤组成：①模板DNA变性：模板DNA经加热至94℃左右后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA会发生解离，成为单链，这样就可以与引物结合；②模板DNA与引物的退火（复性）：在变性过程中模板DNA经加热变性成单链后，将温度降至相应的退火温度左右，引物就会与模板DNA单链的互补序列进行配对和结合；③引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下DNA模板-引物结合物以dNTP为反应原料，模板为靶序列，按照碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。（2）PCR扩增仪器：9700型PCR扩增仪(ABI，USA)本论文主要研究不同来源种泥对富集厌氧氨氧化菌富集的影响。在对种泥做初步筛选时，对于Anammox菌16SrRNA基因的扩增采取巢式PCR的方式，第一步扩增引物为pla46f-630r，第二步为Anammox菌特异引物Amx368f–Amx820r，预计获得片段长度为483bp左右的扩增片段[1]。Anammox菌[2]和全细菌PCR扩增的引物和反应条件如表2.所示，反应体系如表2.所示。Anammox菌第二步扩增产物长度和全细菌扩增产物长度分别为483bp和1465bp，扩增结束后所有PCR产物均通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。表Anammox菌和全细菌PCR扩增的引物和反应条件表Anammox菌和全细菌PCR扩增的反应体系组分ddH2OdNTP混合物10×PCR缓冲液引物1引物2牛血清白蛋白（2%）TaKaRaTaq酶/(5units/μl)模版合计体积/μL18.2522.50.50.50.50.250.525对象引物序列(5’-3’)反应条件浮霉菌目(PCR)pla46fGGATTAGGCATGCAAGTC1)解链，94℃5min；2)30个循环：94℃解链60s，退火温度50℃下60s，72℃延伸120s；3)72℃延伸10min630rCAKAAAGGAGGTGATCCAnammox16SrRNA(PCR)Amx368fTTCGCAATGCCCGAAAGG1)解链，96℃10min；2)30个循环：96℃解链60s，退火温度52℃下60s，72℃延伸60s；3)72℃延伸10minAmx820rAAAACCCCTCTACTTAGTGCCC全细菌16SrRNA((PCR)27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG1)解链，94℃for5min；2)30个循环：94℃解链60s，退火温度55℃下45s，72℃延伸90s；3)72℃延伸10min1492RGGTTACCTTGTTAGGACTT2.6.3定量PCR（1）定量PCR简介定量PCR（Quantitativereal-timePCR，qPCR)）技术，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。现在通用的qPCR检测系统主要有两类：非特异的DNA嵌入染料（如SYBRgreenI）和以杂交形式进行的单链检测系统，有水解探针（如TaqMan）、杂交探针（如Lightcycler）等。它们分别利用PCR延伸和退火阶段产生荧光产物，PCR扩增的每个循环荧光信号都会放大。仪器根据这些荧光物质的特异的波长检测荧光量，并使用分析软件计算出初始模板量。qPCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。本研究采用SYBR®GreenI嵌合荧光法进行qPCR测试。PCR反应生成双链DNA，SYBR®GreenI与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。该法的可对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。（2）qPCR仪器：ABIPrism7300SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems,USA)对Anammox菌的定量是针对功能基因进行的。联氨合成酶（Hydrazinesynthasegene，hzsB）Anammox菌特有的酶，它可催化合成厌氧氨氧化过程中的重要中间产物联氨（N2H4）。Anammox菌[2]和全细菌qPCR[21][22]的引物和反应条件如表2.所示，反应体系如表2.所示。Anammox菌和全细菌扩增产物长度分别为192bp和385bp。表Anammox菌和全细菌qPCR的引物和反应条件对象引物序列(5’-3’)反应条件AnammoxhzsB(qPCR)HSBeta396FARGGHTGGGGHAGYTGGAAG1）解链：95℃3min；2）40个循环：95℃30s,59℃30s，72℃30s；3）收集荧光信号HSBeta742RGTYCCHACRTCATGVGTCTG全细菌(qPCR)341F533RCCTACGGGAGGCAGCAG1）解链：95℃30s；2）40个循环：95℃10s，55℃15s,72℃30s；3）收集荧光信号TTACCGCGGCTGCTGGCAC表Anammox菌和全细菌qCR的反应体系试剂使用量/μlSYBR®PremixExTaq（TliRNaseHPlus）（2×）12.5PCRForwardPrimer（10μM）0.5PCRReversePrimer（10μM）0.5ROXReferenceDye（50×）0.5DNA模板2.0BSA（2%）0.5dH2O（灭菌蒸馏水）8.5Total25（3）标准曲线和质粒浓度计算准备标准曲线，通过克隆获得的标准质粒进行10倍梯度稀释，共做8个浓度（即8个点，如果后面结果中有差异太大的点，可以去掉1到2个，以保证标线的线性）。样品的稀释：本实验中采取5uL样品加到45uL灭菌超纯水中稀释的方法进行梯度稀释。为了保证定量结果的准确性，样品需要混合均匀，然后用离心机离心一下再进行操作。每个标准点又做3个平行样。质粒的制备：首先对目标基因进行PCR，产物进行克隆（克隆技术见下一部分的讲述），测序确认是目标基因，然后用质粒提取试剂盒（如天根质粒提取试剂盒、Fermentas质粒提取试剂盒等）将菌液提取质粒，用NanoDrop测定DNA浓度，作为标准质粒。标准质粒可以用PCR离心管分装-20℃保存，避免反复冻融。如果样品已经稀释好，但是一天测不完多个定量（比如需要同时测试一个样品中的全细菌和anammox），可以将稀释的样品放入4℃即可。因为如果放入-20℃，可能会由于第二天冻融而导致DNA降解断裂。标准质粒的浓度计算：拷贝数浓度(copies/μL)=DNA质量浓度(ng/μL)/DNA分子量(g/mol)×6.02×1023×10-9DNA分子量=660×片段长度(bp)+质粒分子量(见质粒说明书)质粒分子量=质粒载体长度×660660为一对碱基的分子量，1Dolton=1g/mol本试验所用两种DNA长度如表2.所示。表2.本试验中两种DNA总长度DNA种类片段长度载体长度DNA总长度Anammox38630153401全细菌19226922884（4）待测样品的处理预先提取待测样品DNA，同样用NanoDrop测定其