分子生物学实验技术-1

1分子生物学实验西北农林科技大学2015.62目录一、基本操作实验一细菌培养实验二质粒DNA提取实验三琼脂糖凝胶电泳实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验五聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析二、目的基因获取实验七植物RNA提取、定量及电泳分析实验八RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验九质粒载体和外源DNA的连接反应实验十感受态细胞的制备及转化实验十一克隆的筛选和快速鉴定实验十二地高辛标记的Southern杂交3实验报告在完成实验后，必须书写实验报告。一份满意的实验报告必须具备准确、客观、简洁、明了四个特点。写好实验报告除了正确的操作程序外，还必须有赖于仔细的观察及客观的记录，有赖于运用所掌握的理论知识对实验现象和结果的分析和综合能力。实验报告的格式包括以下几方面：1.实验的目的和原理简单扼要地说明进行本次实验的目的和原理。对实验中所用的技术和方法，要作简单的介绍。2.实验操作程序在充分理解操作步骤和原理上。对整个实验操作过程进行概括性的描述，要求简单明了，避免长篇抄录。3.结果处理对实验过程中出现的现象仔细观察，对数据客观记录。然后再进行处理计算等，得出结果。4.讨论这是实验报告中最重要的一部分。首先要对实验结果的准确性进行分析确认，对实验中的误差或错误加以分析，然后综合所观察到的各种现象和数据，做出结论。在此基础上，应运用相关的理论知识及参考文献，结合实验目的、要求进行讨论。对实验中出现的新问题可提出自己的看法，并对自己的实验质量做出评价。4实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养基。三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料大肠杆菌（二）试剂1.胰蛋白胨2.酵母提取物3.氯化钠4.1mol/LNaOH5.琼脂粉6.抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1.培养皿2.带帽试管3.涂布器4.灭菌锅5.无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）6.恒温摇床四、操作步骤（一）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入：细菌培养用胰蛋白胨10g细菌培养用酵母提取物5gNaCl10g5摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/LNaOH调节pH位至7.0。加入去离子水至总体积为lL，在15lbf／in2(1.034×105Pa)高压下蒸气灭菌20分钟。这样得到是LB液体培养基。LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。（二）细菌的培养（１）在液体培养基中培养1.过夜培养⑴取5ml液体培养基加入一只无菌的试管中。⑵用接种环或灭菌牙签挑一个单菌落，接种于培养液中。⑶盖好试管，在摇床上以60r/min速度，于37℃过夜培养。２.大体积培养⑴按1∶100（V/V）的比例将过夜培养物加入到一无菌烧瓶中，烧瓶的体积应该是培养液体积的5倍以上。⑵于37℃，约200r/min剧烈摇动培养。（２）在固体培养基中培养细菌在固体培养基上培养主要是为了获得单菌落和短期保存。平板划线法分离单菌落⑴采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。⑵重新消毒接种环，从第一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复划线直至覆盖整个平板。（见下图）⑶于37℃培养直至长出单菌落。6实验二质粒DNA的提取一、目的学习碱裂解法提取质粒的原理二、原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料含质粒的大肠杆菌DH5α（二）试剂1.LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.0。高压灭菌20分钟。2.LB平板培养基：在每1000mLLB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20分钟。（三）仪器1.Eppendorf管、离心管架2.10，100，1000μl微量加样器3.台式高速离心机4.摇床、高压灭菌锅四、操作步骤（一）培养细菌将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃培养24小时，然后从平板上挑取单菌落，接种于5ml液体培养基中，37℃培养12小时。（二）提取步骤1、柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集7管中。（请使用当天处理过的柱子）2、取1-5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。3、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。4、向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。5、向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm（~13,400×g）离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。6、将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm（~13,400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7、向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。8、重复操作步骤7。9、将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。10、将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm（~13,400×g）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。(三)琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA8实验三琼脂糖凝胶电泳法检测DNA一.目的学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小。二.原理琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测。其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DNA发射的荧光，增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ng的DNA。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。当然也可以用同样的方法检测RNA。三、试剂与主要仪器（一）试剂1.DNA样品2.TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍（配制见附录）3.点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油4.溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶（注意：该试剂具致癌作用，用时要小心）5.琼脂糖（二）仪器1.电泳仪系统2.紫外灯3.恒温水浴箱四、操作步骤1.选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检测稳压电源与正负极的线路。2.选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端，使得点样梳的底9部与电泳槽水平面的距离为0.5~1.0mm。3.制备琼脂糖凝胶：按照被分离的DAN分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。一般情况下可参考下表：琼脂糖的含量（%）分离线装DNA分子的有限范围(kb)0.360~50.620~10.710~0.80.97~0.51.26~0.41.54~0.22.03~0.1称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，一般配制约40ml凝胶液，置微波炉中或水浴加热，至琼脂糖融化均匀。4.将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，并在一端插好梳子。待凝胶溶液冷却至60℃左右时，在凝胶溶液中加EB（EB最终浓度为0.5微克/毫升），摇匀，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡。待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TBE缓冲液），然后小心地拔掉梳子保持点样孔完整。注意：缓冲液要高出凝胶面2㎜。5.待测的DNA样品中，加入1/5体积的点样缓冲液，混匀后小心的进行点样，记录样品点样顺序和点样量。6.开启电源开关，最高电压不超过5V/cm。7.泳时间看实验的具体要求而异，在电泳中途可用紫外灯直接观察，DNA各条区带分开后电泳结束。一般20分钟至3小时，取出电泳凝胶块直接检测拍照。10实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定一、目的学习质粒的酶切及电泳分析。二、原理限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。三、试剂与主要仪器（一）试剂1.EcoRⅠ酶2.λDNA3.TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍