分子生物学实验报告

分子生物学实验报告2011级生物科学师范组长：组员：从甘薯中克隆ADK基因的核心片段（西南大学生命科学学院，重庆400715）摘要：甘薯为我国农业主要栽培作物，并且是分子生物学实验室常见材料，本次实验主要以甘薯叶片（部分为茎）为实验材料，第一次实验从材料中提取RNA并反转录cDNA第一链，经PCR扩增得到大量ADK基因核心片段，电泳检测胶回收ADK基因核心片段，将其与T载体相连并导入大肠杆菌DH5感受态细胞中，扩增之后在加有相应抗生素的LB平板上筛选阳性克隆，这对后续生物信息学分析等有重要意义。第二次实验是用CTAB法提取甘薯DNA，PCR扩增再凝胶电泳检测纯度。（提取DNA也能扩增出ADK基因核心片段）关键词：甘薯、PCR技术、腺苷酸激酶片段（ADK）、基因克隆、转化Abstract:Sweetpotatoformyagriculturalmaincultivationcrop,andismolecularbiologylaboratorycommonmaterial,thistimesexperimentmaintosweetpotatoleaves(partforstems)forexperimentmaterial,firsttimesexperimentfrommaterialintheextractionRNAandreverserecordedcDNAfirstchain,byPCRspreadincreasedgetlargeADKgenecorefragments,electrophoresisdetectionrubberrecyclingADKgenecorefragments,willitsandtcarrierconnectedandimportEscherichiacoliDH5(feelStatecellinthe,spreadincreasedinplushascorrespondingantibioticsofLBTabletShangfilterpositivecloneThisimportancetosubsequentbioinformaticsanalysis.ThesecondexperimentwasextractedbyCTABmethodDNA,PCRamplificationandgelelectrophoresisandpurityofsweetpotato.(ExtractionofcorefragmentofDNAcanbeamplifiedADKgene)keywords:sweetpotato;PCRtechnologies;AdenylateKinaseGene(adk);geneclone;transformation1.综述1.1甘薯甘薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)属旋花科(Convolvulaceae)甘薯属((Ipomoea)蔓生一年生草本植物，染色体数为2n=6x=90。其又名山芋、红芋、番薯、红薯、白薯、地瓜、红苕等，因地区不同而有不同的名称，经济价值较高可食用也可入药。世界甘薯主要产区分布在北纬40°以南。栽培面积以亚洲最多，非洲次之，美洲居第3位。1994年世界甘薯总面积为938万公顷，总产量为12433.9万吨。甘薯是我国的主要栽培作物，常年种植面积6×106hm2左右,栽培面积和总产量均居世界首位，它所富含的淀粉是重要的轻化工和食品加工原料。选育推广优良品种是农业增产的重要措施，因此，在农业科技工作中，选育和推广优良品种始终处于重要地位，“渝苏303”是西南师范大学在育成“渝苏1号”、“渝薯34”、“渝薯20”之后，于1991年从江苏省农科院提供的杂交种籽中选育而成的又一个甘薯新品种，原系号“91一31一303”，该品种（系）1994—1995年参加四川省甘薯新品种区域试验，1997年5月、1998年1月和1999年4月分别通过四川省、重庆市、江苏省农作物品种审定委员会审定，1998年该品种在重庆、四川、江西、江苏、贵州、河南等省市的种植面积在1×104hm2以上。经过较长较深时间的研究，甘薯应经成为西南大学生命科学学院分子生物学实验室的常用材料，从分子生物学角度对其进行基因水平上的实验研究对于提高甘薯的质量和产量都有重大意义。1.2ADK基因腺苷酸激酶(EC.2.7.4.3,adenylatekinase,ADK)是生物体内普遍存在的一种单体酶，广泛存在于生命有机体中（如微生物、植物和动物体内）。腺苷酸激酶（ADK）催化ATP和AMP合成两分子ADP的可逆反应，是调控这三种前体分子在淀粉代谢库和核酸代谢库中分配的关键酶。其表达量直接影响腺苷酸在糖类代谢库和核酸代谢库中的分配。生物信息学分析表明,在淀粉合成水平最高的植物中,腺苷酸激酶的分子进化水平和遗传相似性也最高，因此,作为腺苷酸代谢库调节中枢的ADK基因(adk)是淀粉代谢工程的重要候选基因,将该基因表达量控制在较低水平就可打破腺苷酸代谢库的平衡,使腺苷酸代谢流向淀粉合成的方向流动。用基因工程技术获得的含有ADK基因工程菌菌株可用于遗传转化马铃薯、甘薯和木薯等重要的淀粉作物,为实现淀粉代谢工程奠定了基础。IbADK全长1314bp，其编码区长度为855bp，编码长度为284个氨基酸残基的ADK蛋白(IbADK)；生物信息学预测IbADK分子量为30.86kDa，等电点为6.46。1.3研究目的和意义本次试验就是利用从甘薯“渝苏303”中提取ADK目的基因，通过连接制备重组DNA，然后导入到大肠杆菌细胞中，通过筛选检测目的基因是否转化成功。本次实验涉及甘薯总RNA的提取，反转录成cDNA第一链过程，PCR扩增目的基因及检测，目的基因回收与连接，大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备，连接产物的转化筛选和PCR检测，以及选做实验植物DNA的提取及检测。原理上根据目的基因的制备，重组DNA分子的构建，重组DNA分子转移到受体细胞，转化子的筛选，和目的基因表达与功能的鉴定的操作步骤，从分子层面直观的告诉我们了基因工程技术中的操作方法和实现手段。腺苷酸激酶(ADK)在维持细胞能量平衡中起着重要作用,也就对农作物的产量的提升具有很大的重要作用，不仅是在农作物光合作用的效率的提升上，也在像甘薯这样积累淀粉的农作物的生产量的提高上面具有很大的作用。弄清楚了甘薯中的ADK基因的序列，对于有征对性的提高甘薯的产量具有直接的关系。2.材料与方法2.1材料2.1.1实验材料：甘薯叶片2.1.2实验工具PCR扩增仪，电泳仪，恒温培养箱1台，恒温水浴锅，THZ-C水平摇床2台，离心机1台，超净工作台1台，移液枪1套，锥形瓶3×10个，室内使用的大中型枪头各1盒，两面板（蓝板）1个，室内使用的1.5mL的EP管1套。涂布器1根，凝胶成像系统1台，一次性PE手套，研钵﹑杵、药勺1套。2.1.3实验试剂裂解液RZ，氯仿，无水乙醇，蛋白液RD，漂洗液RW，loadingbuffer，SuperPuredNTPS,RNase-FreeddH2O,buffer,RNasin,TIANScriptM-MLV,MiniQH2O,10×PCRbuffer,MgCl2,dNTPmix,引物1，引物2，Taq,琼脂糖，TAE,GoldView，β-巯基乙醇，平衡液BL，PN,缓冲液EB,PMD-19Vector，InsertDNA,SolutionⅠ，CATB,液氮，异丙醇，乙醇，CaCl2，LB液体培养基，Amp抗生素，IB固体培养基2.2方法2.2.1植物RNA的提取及检测及反转录植物RNA的提取实验方法参见总RNA提取试剂盒说明书。反转录过程如下：1.在离心管中加入2ulRNA，2ul引物，2ulSuperPureDntps,8.5ulRNase-FreeddH2O2.70℃水浴加热5分钟后，冰上冷却2分钟，再进行简短离心3.加入4ulBuffer，0.5ulRNasin4.加1ulTIANScriptM-MLV,轻轻用移液器混匀注意事项如下：1.第一次离心过后，吸取上清液400ul另一离心管中，呈淡粉色。2.共经过7次离心，均为常温离心，每次离心后加入的试剂不同，需细心。3.简短离心的步骤与正常离心不同，控制时间2.2.2PCR扩增adk基因核心片段（1）在2个50ul的PCR反应管中依次加入如下组分:PCR反应体系：1)MiniQH2O39.5μl2)10×PCRbuffer（含Mg离子）5μl3)10mMdNTPmix1μl4)引物1(10μM)F-ADK1μl5)引物2(10μM)R-ADK1μl6）Taq(2to5units/ul)0.5μl7)模板(DNA)2μl总体积50.0μl（2）短暂离心混匀各组分后，将PCR反应管放入PCR仪。PCR反应的程序如下:Ⅰ）94℃4minⅡ）94℃45s；56℃45s；72℃1min（33个循环）Ⅲ）72℃8minⅣ）4℃保存（3）将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照记录实验结果。2.2.3胶回收adk基因片段和连接T载体及大肠杆菌的培养1）胶回收adk基因片段按照提供的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒—-离心柱型中所述的方法对已检测并可使用的adk基因片段进行回收1.柱平衡步骤：向吸附柱CA2中加入500ul平衡液BL,12000rpm(～13400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。2.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。3.向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，因为凝胶重为0.1g，其体积可视为100ul，以此类推。50℃水浴放置10分钟，期间不断温和的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。4.将上一步所得溶液加入另一个吸附柱CA2中室温放置2分钟，12000rpm（～13400×g）离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。5.向吸附柱CA2中加入700ul漂洗液PW，12000rpm（～13400×g）离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。6.向吸附柱CA2中加入500ul漂洗液PW，12000rpm（～13400×g）离心30～60秒，倒掉收集管中的废液。7.将吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm（～13400×g）离心2分钟，尽量出去漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底晾干。8.将吸附柱CA2放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30ul洗脱缓冲液EB，水浴37℃2分钟。12000rpm（～13400×g）离心2分钟收集DNA溶液。2)连接T载体1.在200ulEP管中加入下列组分：PMD-19TVector0.5ulInsertDNA4.5ulSolutionⅠ5ul2.轻轻混匀，16℃连接30分钟3）大肠杆菌摇床培养部分同学在老师指导下已完成2.2.4DNA的提取及大肠杆菌感受态细胞的制备1）DNA的提取1、向10ml离心管中预先加入4mlCTAB抽提液及相应量的β-巯基乙醇（2%-3%），65℃预热；2、取适量的植物甘薯嫩叶用液氮充分磨成粉末，转入该10ml离心管中，迅速混匀。3、于65℃水浴45min，中途间隔（轻柔）颠倒混匀三次或四次；4、冷至室温后加入等体积(4ml)氯仿，轻柔颠倒混匀使乳化10min；5、10000转／分离心10min（18-20℃）；6、吸取上清3-4ml于另一干净的10ml离心管中；7、吸取上清加入与上清液等体积且已于-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟至白色絮状沉淀出现；8、用玻璃钩子挑出DNA，放入盛有1ml75%乙醇的1.5mlEppendorf管中9、用75%乙醇中漂洗DNA沉淀，用Tip头吸干乙醇；10、用1ml75%乙醇再漂洗一次；11、用无水乙醇再漂洗一次；12、沉淀于室温或60℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明；13、用500μlTE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，得DNA粗提物。14、取10μlDNA电泳检查DNA的质量；2）大肠杆